慢性飲水型鎘中毒對兔膝關節軟骨Ⅱ型膠原、糖胺多糖mRNA表達的影響及意義

馬向輝，向 川，衛小春

隨著人口及全球經濟的迅速發展，人類對水資源需求量越來越大，重金屬污染問題也日益嚴重。鎘在重金屬水污染中占了相當大的比例，被美國毒物管理委員會(ATSDR)列為第6位危害人類健康的有毒物質［1］。鎘污染的水可污染土壤致農作物中鎘含量異常增高［2］，攝入體內可影響機體健康。鎘中毒可導致骨質疏松和腎臟損傷［3］。人們關注重金屬污染對骨骼的危害，但對關節軟骨、滑膜的影響尚不清楚。本研究通過觀察飲水型鎘中毒兔膝關節軟骨中Ⅱ型膠原、糖胺多糖mRNA表達的變化，探討鎘污染對人體軟骨的影響，為治理水資源重金屬污染提供理論依據，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:健康新西蘭雄兔40只，由山西醫科大學實驗動物中心提供，2．5月齡，平均體重(1．38±0．18)kg。隨機分為實驗組和對照組，每組20只，分籠喂養;平均體重實驗組為(1．38±0．18)kg，對照組為(1．38 ±0．21)kg。

1.1.2 儀器與試劑:氯化鎘(25 g/瓶，天津市大茂化學試劑廠);第一鏈cDNA合成試劑盒(Fermentas公司);MSYBRTMSYBR Green/熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)混合液(2X)，#K0241試劑盒(Fermentas公司);TRIzol試劑盒(TaKaRa寶生物工程有限公司公司);引物與內參序列來自文獻(TaKaRa寶生物工程有限公司);異丙醇、無水乙醇和氯仿(西安化學試劑廠);IQ5 Optical Module型PCR擴增儀(美國Bio-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1 鎘中毒模型的制備:對照組用正常飲用水飼養;實驗組用40 mg/L氯化鎘飲用水飼養3個月制備慢性鎘中毒模型。

1.2.2 取材:3個月后，兩組隨機分別抽取3只雄兔采用耳緣靜脈空氣栓塞法處死，完整剖取雙膝關節軟骨，分別放入玻璃瓶中－70℃保存。

1.2.3 總RNA的提取:將已編號的實驗組及對照組共6只雄兔軟骨組織標本從－70℃冰箱取出約100 mg，放研缽中加液氮研磨，研磨至粉末狀。加入Trizol試劑1 ml(50～100 mg組織/ml)，吹打混勻，轉移至EP管中，靜置5 min，使得核酸蛋白復合物完全分離。將 EP管中加0．2 ml氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫靜置2 ～3 min，12 000 g×15 min，4℃。可見上層水相，中間混合相，下層酚相，吸取上層水相500μl至新的EP管中。加入500μl預冷的異丙醇，顛倒混勻。室溫放置10 min，12 000 g×10 min，4℃。吸去液體可見白色膠狀沉淀，加入1 ml預冷75%乙醇(750μl乙醇+250μl Rnase-free H2O)，混勻洗滌，7500 g×5 min，4℃。棄上清，晾干，加Rnase-free H2O 50 μl，混勻后分裝于 0．5 ml小 EP管中(每管10μl)，將小 EP管放于 －70℃冰箱保存。微量分光光度計測 RNA的純度與濃度，OD260/OD280均在 1．8 ～2．0，將其濃度稀釋為100 ng/μl后分裝于小EP管中。

1.2.4 mRNA的反轉錄:應用oliged(dT)18引物1 μl、DEPC 處理的水8 μl、5× 反應緩沖液 4 μl、RiboLock核糖核酸物抑制劑1μl、10 mM dNTP混合液2μl、M-MuLV 反轉錄酶2 μl、總 RNA 2 μl(終濃度100 ng/μl)配制RT反應液(反應液配置在冰上進行)及配成20μl的反應體系。

反轉錄反應條件如下:37℃，15 min(反轉錄反應);85℃，5 s(反轉錄酶的失活反應)。反轉錄在美國Bio-RAD公司的C1000型PCR熱循環儀上進行。結束后上微量分光光度計測cDNA的含量和純度:加入待測樣，OD260/OD280比值在1．7～1．9范圍內，純度好，將其濃度稀釋為50 ng/μl后分裝于小EP管中，最后將小EP管放入－70℃保存。

1.2.5 cDNA PCR擴增:應用 MSYBRTMSYBR Green/熒光定量 PCR混合液12．50μl、DEPC處理的水9．00 μl(終濃度 0．1% 體積/體積)、上游引物0．75 μl(終濃度 1．33 μmol/μl)、下游引物 0．75 μl(終濃度 1．33 μmol/μl)、cDNA 2 μl(終濃度50 ng/μl)配制 RT反應液(反應液配置在冰上進行)及配成25μl的反應體系。

擴增反應條件如下:預變性:95℃ 30 s，循環1次。PCR 反應:95℃變性5 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共 40個循環熔解曲線。95℃ 60 s，55℃30 s，95℃ 30 s，循環61次。cDNA擴增在美國Bio-RAD公司的IQ5 Optical Module型PCR擴增儀上進行。每份樣品和內參照均設3個重復，共36孔。反應在96孔PCR板中進行。

PCR引物序列由 TaKaRa公司設計合成［4］，具體序列見表1。

表1 實時定量PCR引物序列

1.2.6 Ct值:通過計算機軟件來測量與計算Ct值，通過2-△△Ct方法計算相對轉錄水平。

1.3 統計學方法 應用SPSS 17．0統計軟件包進行數據分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用完全隨機單因素方差分析，兩兩比較用LSD法，α=0．05為檢驗水準。

2 結果

2.1 Ⅱ型膠原、糖胺多糖的mRNA結果 每份待測樣品的目的基因和內參照基因均設3個重復孔，共36孔，同一個樣品的相同基因三條擴增曲線均平滑完整、重復性良好。熔解曲線分析顯示，目的基因和內參基因的曲線均成單一峰，熔解溫度均一，峰形銳利。在反應曲線的其他位置未見到波形，說明擴增產物為特異性產物。見圖1～3。

圖1 兩組Ⅱ型膠原基因擴增和熔解曲線圖

圖2 兩組糖胺多糖基因擴增和熔解曲線圖

圖3 兩組甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因擴增和熔解曲線圖

2.2 Ⅱ型膠原、糖胺多糖mRNA的表達 軟骨細胞中Ⅱ型膠原、糖胺多糖mRNA陽性表達實驗組分別為13．785±1．447 和 2．512 ±0．740，對照組分別為1．001 ±0．345 和1．009 ±0．151，差異有統計學意義(P ＜0．05)。

3 討論

正常關節軟骨的成分為軟骨細胞、軟骨細胞外基質和水。軟骨細胞僅占軟骨總量的1%，具有分泌合成及維持細胞外基質的功能。細胞外基質由膠原、蛋白聚糖、組織液、非膠原蛋白等組成。膠原纖維是關節軟骨的內骨骼，構成軟骨的基本框架，具有維持關節軟骨形態結構和抗張力強度的功能，以Ⅱ型膠原為主，可占軟骨膠原總量的90%左右。蛋白聚糖是由蛋白質和大量糖胺多糖(透明質酸，硫酸軟骨素A、C和硫酸角質素)組成，糖胺多糖鏈連接中心蛋白分子組成蛋白聚糖，其含量與蛋白聚糖成正比。組織液中含有水、電解質、氣體，小分子蛋白質和代謝產物。液體和基質大分子間的相互作用為組織提供硬度和抗機械壓力。關節軟骨的生理特性依賴于軟骨細胞和細胞外基質的相互作用，軟骨細胞能感受細胞外基質成分的變化并作出反應，以維持分解與合成的代謝平衡，保持關節軟骨的正常功能［5］。

由于病理學改變與臨床表現程度不一致，骨關節炎(OA)目前仍無統一的科學性定義。但關節軟骨退行性變及破壞是其基本病變［6］。引起軟骨降解的原因是軟骨細胞的凋亡及細胞外基質成分的降解。Matyas等［7］的研究發現在OA早期，關節軟骨Ⅱ型膠原和蛋白多糖核心蛋白的mRNA表達均明顯增高，且Ⅱ型膠原的mRNA表達明顯高于蛋白多糖核心蛋白，而軟骨細胞DNA含量無明顯增加，認為Ⅱ型膠原分泌增加是由于其mRNA表達增加所致，兩者表達不平衡可能導致OA。OA時軟骨內羧基端前肽含量升高明顯，在中間層和深層表現更加明顯，這更進一步證實OA時軟骨內Ⅱ型膠原分泌量增加。

本研究顯示，實驗組Ⅱ型膠原和糖胺多糖的mRNA表達均明顯增高，同時發現，前者表達明顯高于后者。有研究顯示，輕度損傷的OA軟骨實驗組與對照組相比Ⅱ型膠原和糖胺多糖的基因表達均增加，但程度不等，Ⅱ型膠原基因表達增加8倍，蛋白多糖的基因表達則增加2倍，明顯失衡［8］。本實驗結果與此類似。推測在OA的早期，基質損傷，膠原的降解增加，軟骨細胞代謝活躍，軟骨細胞Ⅱ型膠原mRNA表達增加，膠原的合成增加以修復軟骨損傷。糖胺多糖為蛋白聚糖的主要成分，其表達增加也參與軟骨修復，但二者表達失衡也可能是OA發病的一個原因。

本研究結果提示，慢性飲水型鎘中毒可以造成兔膝關節軟骨損傷，推測損傷持續則可能導致嚴重OA。進一步研究顯示，OA中Ⅱ型膠原、糖胺多糖等的合成、降解及其調控因素，能加深對OA病因的進一步了解。鎘可致多種細胞凋亡，但能否致兔膝關節軟骨凋亡及其具體機制尚未明了，有待進一步研究。

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［8］ Nelson F，Dahlberg L，Laverty S，et al．Evidence for altered synthesis of typeⅡcollagen in patients with osteoarthritis［J］．JClin Invest，1998，102(12):2115-2125．