EPO對心肺復蘇后大鼠海馬神經元的細胞凋亡、Bcl－2及Bax表達的影響

孫曉佳，孫 宇，孫 霓，王勝軍，李秀江＊

（1.吉林大學第一醫院 重癥監護科，吉林 長春 130021；2.吉林省腫瘤醫院 重癥監護科，吉林 長春 130012）

隨著心肺復蘇術的發展國內外文獻報道心肺復蘇成功率有所提高，但腦復蘇率未見明顯提高。其根源在于腦組織未能及時得到保護治療。因此，心肺復蘇是決定預后的基礎，腦復蘇則是決定預后的關鍵。究其機制與缺血缺氧及再灌注損傷與神經存活信號轉導通路及神經元的凋亡有密切關系。文獻報道EPO對神經細胞具有營養和抗凋亡的雙重作用，但其作用機制仍未完全明了。國內尚無從心肺復蘇角度探討EPO的抗神經細胞凋亡機制的研究，本實驗觀察EPO對心肺復蘇術后大鼠海馬神經細胞凋亡、Bcl－2及Bax表達的影響，以探討心肺復蘇后神經元損傷及促紅細胞生成素的保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

健康Wistar雄性大鼠32只，無菌級，體重220－270 g，由吉林大學實驗動物部提供。飼料為繁育鼠全價固體顆粒飼料，吉林大學實驗動物部提供。EPO沈陽三生制藥股份公司提供。原位末端標記檢測（TUNEL）試劑盒、Bcl－2兔多克隆抗體、Bax鼠單克隆抗體購于SantaCurz公司，SABC試劑盒及DAB顯色試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。水合氯醛、PBS及其它試劑均為國產分析純級。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及動物模型制作 健康Wistar雄性大鼠32只，隨機分4組，每組8只。正常對照組（A組）、假手術組（B組）、心肺復蘇模型組（C組）、EPO干預組（D組）。腹腔注射10%水合氯醛麻醉（300 mg／kg）后，分離并切開氣管，行氣管插管術連接動物呼吸機，設置容量控制模式，呼吸頻率70次／min，潮氣量8 ml／kg；分離右側頸總動脈，插導管，連接多導生理儀用Pclab軟件傳導并監測血壓、心電圖；分離左側頸總靜脈留置輸液管。A組不給予任何處置。C、D組手術操作完成后，穩定10 min，然后在呼氣末夾閉氣管使大鼠窒息7－9 min，在當大鼠收縮壓≤30 mm Hg并出現心臟停搏時［1］，立即開放呼吸機，吸入100%純氧，胸外按壓，當大鼠出現自主心律、脈搏波、收縮壓≥60 mm Hg，并持續10 min以上判定為自主循環恢復（re－turn of spontaneous circultion，ROSC），必要時予腎上腺素或多巴胺協同復蘇。C組心肺復蘇同時給予EPO 3000U／kg左側頸總靜脈注射。B組僅給予等劑量生理鹽水左側頸總靜脈注射。

1.2.2 標本采集與組織學檢查 4 h后給予全部存活大鼠10%水合氯醛過量麻醉，用37℃生理鹽水250 ml經心臟灌注快速沖洗去除血細胞，再用4℃多聚甲醛250 ml灌注固定后斷頭取腦，經4%多聚甲醛后固定24－48 h后，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡觀察組織學變化。

1.2.3 原位細胞凋亡檢測 步驟：①標本切片常規脫蠟水化；②配制新鮮3%H2O2室溫孵育10 min；③稀釋新鮮Proteinase K37℃消化10 min；④加標記液，37℃標記2h；⑤加封閉液室溫30 min；⑥加生物素化抗地高辛抗體37℃反應30 min；⑦加SABC，37℃反應30 min；⑧DAB顯色；⑨蘇木素輕度復染，脫水、封片，顯微鏡下觀察。細胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞，即凋亡細胞。每張切片取5個高倍鏡視野（400×）計數，取平均值，為該切片凋亡細胞數。

1.2.4 Bcl－2、Bax免疫組織染色 步驟：①標本切片常規脫蠟水化；②3%H2O2室溫孵育15 min滅活內源性過氧化物酶；③0.1%TBS中行微波抗原修復10 min；④正常山羊血清室溫孵育15 min，封閉非特異性抗原；⑤滴加滴加一抗，（1∶100），4℃過夜；⑥滴加生物標記二抗37℃孵育20 min；⑦滴加辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素37℃孵育20 min；⑧DAB顯色；⑨水洗、復染、封片、光鏡下觀察?？瞻讓φ諏嶒炗肞BS代替抗體。Bcl－2陽性細胞胞漿／胞膜被染成棕黃色，每張切計數5個高倍鏡視野（400×），取平均值，為該切片陽性細胞數。

1.3 統計學分析

使用SPSSn.5統計軟件處理數據。實驗數據用均數士標準差（±s±s）表示。兩組間樣本均數的比較采用t檢驗，組間比較采用成組單因素方差分析。以P＜0.01為有統計學意義。

2 結果

2.1 形態學染色結果HE染色

A、B組海馬神經細胞未見明顯的形態學改變，C組海馬神經細胞缺血性改變明顯，細胞變小、有固縮，核呈三角形、條形、有固縮，核仁濃縮。D組可見部分細胞固縮，核仁濃染，但缺血性改變較輕。

2.2 原位細胞凋亡檢測結果

A、B組未見陽性細胞，C組可見陽性細胞，其細胞核中有大量棕黃色顆粒。高倍鏡下可見到細胞核周質靠近胞膜處有數個散在的深染的圓形顆粒狀結構，即凋亡小體。C組凋亡細胞數明顯高于A、B組，比較有顯著差異（P＜0.01）。D組凋亡細胞數目明顯低于C組，比較有顯著性差異（P＜0.01）。

2.3 Bcl－2、Bax的表達結果

A組和B組可見少量Bcl－2、Bax陽性細胞，兩組間比較差異無顯著性（P＞0.01）。C組可見較多Bcl－2、Bax陽性細胞表達，與A組和B組相比，有顯著性差異（P＜0.01）。D組Bcl－2陽性細胞表達高于C組，差異有顯著性（P＜0.01）。D組Bax陽性細胞表達低于C組，差異有顯著性（P＜0.01）。

3 討論

心肺復蘇后引起腦組織損傷的原因很多，但主要為心跳驟停期間組織嚴重缺血缺氧以及復蘇后再灌注所致，再灌注損傷時，氧自由基的大量增加及細胞凋亡的激活被認為是損傷發生的重要機制，目前認為抑制復蘇后發生的細胞凋亡的激活是改善復蘇后腦組織功能的途徑之一。EPO屬于細胞因子超家族中的一員，除刺激造血外，還具有抗凋亡及細胞保護的作用［2，3］，是近年來研究較多的一個指標。EPO及EPOR廣泛存在各種組織中，包括神經系統。研究表明，EPO對神經系統的發育、保護和修復具有重要作用［4］，在體內細胞培養中Hasselblatt等［5］發現EPO可抑制谷氨酸誘導的神經細胞死亡。本實驗可見C組海馬神經細胞細胞變小、有固縮，核呈三角形、條形、固縮，核仁濃縮，缺血性改變明顯。D組可見部分細胞固縮，核仁濃染，但缺血性改變較C組輕。細胞凋亡檢測結果可見D組凋亡細胞數較C組減少，說明EPO可抑制大鼠海馬神經細胞凋亡，與國內外研究結果一致。

bcl－2、bax是己經明確的參與細胞凋亡調節的基因。bcl－2是重要的凋亡抑制基因，其基因產物Bcl－2與促凋亡基因bax的基因產物Bax相結合形成異源二聚體可產生抑制細胞凋亡的作用，Bax自身形成同源二聚體時可加速細胞凋亡。因此Bcl－2和Bax蛋白含量的比值決定細胞凋亡過程的發生的過程［6－8］。結合本實驗A、B組大鼠海馬組織可見少量Bcl－2、Bax陽性細胞，C組與 A、B組相比較Bcl－2陽性細胞數增加，表明腦缺血再灌注損傷可以產生保護性細胞因子，從而上調bcl－2的表達抑制細胞凋亡；D組Bcl－2陽性細胞顯著多于C組，說明EPO能上調Bcl－2表達，減輕腦組織的凋亡。同時D組Bax陽性細胞顯著少于C組，表明EPO可以下調Bax的表達，降低Bax對凋亡的促進作用，從而保護腦組織。

表1 4組大鼠腦海馬神經元細胞凋亡、Bcl－2和Bax表達情況

［1］陳壽權，李章平，王姍姍等.窒息法致大鼠心臟驟停模型復蘇的影響因素［J］.中華急診醫學雜志，2005，14（10）：814.

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