雙抗體夾心ELISA檢測人胎兒血紅蛋白體系的建立

李雪麗，文李艷，馮善偉，鐘 梅，劉艷君＊，富 寧

（1.南方醫科大學基礎醫學院 免疫教研室，廣東 廣州 510515；2.廣州市人口和計劃生育科學研究所，廣東 廣州 510410；3.南方醫科大學 南方醫院，廣東 廣州 510515）

胎兒血紅蛋白（Fetal Hemoglobin，Hb F）由2條α鏈和2條γ鏈組成，出生時約占血紅蛋白總量的70%，然后快速減少，6－12個月后濃度小于2%，到成年時降至血紅蛋白總量的1%以下。在許多血液系統疾病尤其是β地中海貧血的篩查中，檢測Hb F是一項不可或缺的指標［1］。在某些惡性腫瘤中，Hb F可作為腫瘤標記物預示腫瘤的發生發展［2］。在產科疾病中，檢測HbF可以快速判定胎兒向母體出血等疾病［3］。目前檢測Hb F多采用蛋白質電泳、抗酸染色和堿變性法，這些方法靈敏度比較低，而靈敏度和準確度較高的高效液相色譜法價格昂貴，不適合大規模篩查［4］。本研究利用自制的抗人Hb F單克隆抗體和兔抗人Hb F多克隆抗體，建立了HbF的單多抗夾心ELISA檢測體系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 抗人HbF單抗2C8、多抗均由本室自制［5］，HRP－羊抗兔IgG為北京鼎國生物公司產品；BSA購自廣州斯佳生物技術公司。自行配制以下試劑：紅細胞裂解液（Tris－NH4Cl）包被液系0.05 M 碳酸鹽緩沖液（CB，p H9.6）、ELISA 封閉液（5%脫脂奶粉，用洗液配制）、洗液（50m MTris，0.14 M NaCl，0.1%Tween－20，p H8.0）、樣品稀釋液（50 m M Tris，0.14 M NaCl，1%BSA，0.05%Tween－20，p H8.0）、TMB底物液（臨用前 A、B液等體積混勻）、2M H2SO4終止液均自行配制。

1.1.2 主要儀器 多功能酶標儀Perkin Elmer wallac1420；自動洗板機購自美國BIO－RAD公司；37℃數顯三用恒溫水浴箱，購自金壇市醫療儀器廠。

1.1.3 血液樣本 臍帶血取自南方醫院產前診斷中心，標準品為本實驗室工作人員的全血標本；100份血標本取自廣州市人口和計劃生育科學研究所，以上標本均用高效液相色譜法測定其 含量，于－70℃保存。

1.2 方法

1.2.1 樣品及標準品的制備 用本室工作人員的全血標本作為標準品，對該份標本用高效液相色譜法測定Hb F的含量（百分比），五分類血球儀測定總血紅蛋白（Hb），分裝并保存于－20℃。取一定體積的標準品或待測血樣品，加入9倍體積的Tris－NH4Cl裂解，37℃水浴30 min，加入10×樣品稀釋液，8 000 rpm離心5 min，取裂解液上清用樣品稀釋液稀釋一定的比例。

1.2.2 檢測HbF雙抗體夾心ELISA方法的建立用0.05 M CB（p H 9.6）稀釋捕獲抗體2C8至10 μg／ml，每孔100μl包被，4℃過夜；次日洗液洗滌3遍后，每孔加入5%脫脂奶粉封閉液300μl，37℃2 h；洗滌5遍后，每孔加入100μl標準品及待測樣品，于37℃孵育30 min；洗滌5遍后，加入兔抗人Hb F多抗10μg／ml，100μl／孔，37℃30 min；洗滌5遍后每孔加入100μl HRP－羊抗兔IgG（1∶5000），37℃30 min；充分洗滌后加入TMB底物液，常規顯色，2MH2SO4終止反應，以波長450 nm測定OD值。以Hb F濃度作為自變量，OD450作為應變量，進行曲線擬合，繪制標準曲線。

1.2.3 100份血標本的檢測 用自行建立的Hb F檢測體系測定100份全血標本的HbF濃度，每份血標本設立雙復孔測定。結果用SPSS13.0進行統計分析。

2 結果

2.1 標準品測定 經測定標準品Hb為137 g／L，Hb F含量為1%。將其裂解后分別稀釋為24.66、4.932、0.986、0.197、0.039μg／ml，作為本檢測體系標準曲線的五個測定點。

2.2 確定捕獲抗體2C8的最佳工作濃度 在檢測抗體濃度為5μg／ml時，用不同濃度的2C8抗體包被，進行夾心ELISA檢測臍血中Hb F的濃度。結果如圖1，當單抗的包被濃度為10μg／ml時，ELISA測定的吸光度值最高，因此，單抗的包被濃度選擇為10μg／ml。

2.3 確定檢測抗體的最佳工作濃度 在單抗包被濃度為10μg／ml的條件下，用不同濃度的兔抗Hb F多抗檢測臍血中Hb F的濃度，比較其檢測效果。結果如圖2，當多抗濃度為10μg／ml，吸光度值較高且與15μg／ml效果相仿，因此，檢測抗體的濃度選擇為10μg／ml。

圖1 抗HbF單抗2C8不同包被濃度的檢測效果比較

圖2 兔抗HbF多抗不同濃度檢測效果的比較

2.4 標準曲線的建立 標準品裂解后稀釋至相應濃度，進行ELISA測定。通過抗原濃度的自然對數Ln（X）與OD450值繪制標準曲線圖。結果如圖3，標準曲線的回歸方程Y＝0.1017Ln（X）＋0.5472，r2＝0.9986.線性范圍在0.039－24.66μg／m之間，能夠滿足臨床血標本檢測的需要。

圖3 HbF濃度的自然對數Ln（X）與OD450值關系圖

2.5 可重復性測定

2.5.1 標準曲線的可重復性 分別比較6次實驗中標準曲線Y軸90%、50%、10%各點所代表的Hb F濃度，其變異系數見表1。結果可見，3個OD450點所代表的濃度值的變異系數均小于15%，說明標準曲線的可重復性較好。

表1 標準曲線的可重復性測定（n＝6）

2.5.2 批內、批間差異測定 取3份含不同Hb F濃度的全血標本，與標準曲線同時測定，每次實驗每種濃度進行6次重復測定（每次測定設立2復孔，取其平均值為一個實驗數據，即每種濃度同時做12孔），反復進行6次重復實驗，計算批間批內變異系數，結果見表2、3。本體系批內平均變異系數6.6%，批間平均變異系數6.4%，說明本檢測體系的可重復性好。

表2 HbF檢測實驗批內可重復性測定（n＝6）

表3 HbF檢測實驗批間可重復性測定（n＝6）

2.6 100份血標本的HbF含量檢測結果 100份血標本的ELISA結果與高效液相色譜法結果比較如表4，以HbF占總血紅蛋白的1%作為臨界值，ELISA結果與高效液相色譜法符合率為89%，經χ2檢驗，兩種檢驗方法之間無統計學差異（χ2＝0.216，P＞0.05）。

表4 100份血標本測定的卡方檢驗表格

3 討論

本研究利用自行制備的抗人HbF單抗和多抗成功地建立了人Hb F檢測體系。在前期單抗的制備和鑒定中，我們用ELISA、Western blot證明了包被抗體2C8只與Hb F發生特異性結合，與其他兩種血紅蛋白（Hb A、Hb A2）無交叉反應［5］，本體系采用單抗作為捕獲抗體，保證了檢測的特異性。在包被單抗已特異地捕獲抗原的基礎上，多抗與抗原結合的位點和機會都大于單抗，因此，以多抗作為檢測抗體，又能保證檢測的靈敏度［6］。由于血標本中Hb F的含量并不會很低，因此本體系更偏重于考慮標準曲線的線性關系和檢測的特異性，同時，略低的靈敏度也可避免樣品稀釋倍數過高而造成的誤差和不便。本研究結果顯示，Hb F的檢測靈敏度為0.039μg／ml，標準曲線的擬合系數達到0.9986，線性關系好，批內變異系數小于10%，批間變異系數小于15%，重復性較好。

Hb F的γ鏈有兩種類型：Gγ和Aγ，二者的差別僅為一個氨基酸不同，Gγ136位為甘氨酸，Aγ為丙氨酸。胎兒出生時Hb F含量為總血紅蛋白的80%，Gγ占 Hb F的比例為70%，Aγ占30%［7］。至兒童和成人，Gγ占Hb F的比例下降至40－60%。本科室制備的抗Hb F抗體，是用臍血免疫的，前期工作中嘗試過以臍血作為標準品，但由于臍血中兩種γ鏈比例與成人不同［8］，臍血與正常人血檢測結果存在一定差異。因預期臨床樣本均來自兒童或成人，為使標準品與檢測標本一致，我們選擇正常人全血標本作為標準品。在檢測Hb F的方法中，高效液相色譜法的準確性最高［4］，因此，標準品的定值采用的是高效液相色譜法。在實驗中，我們發現血液標本的凍融次數對于紅細胞裂解有一定影響。為保證結果的一致性，標準品和檢測標本的凍融次數盡量一致，而在裂解之后加入10×樣品緩沖液，既能終止Tris－NH4Cl的裂解，又可使各個濃度梯度的樣品處于相同的緩沖條件中。

應用自行建立的ELISA檢測了100份血標本，所測值與高效液相色譜法的結果比較，以HbF 1%作為臨界值，發現兩種方法的符合率約為89%，雖然比較兩種方法測定的絕對值，符合率只有40%，但這種差異對于臨床以1%為臨界值判斷Hb F的病理水平并無影響，因此，本ELISA方法可在一定程度上代替高效液相色譜法，更廣譜、低廉地應用于臨床和基礎研究。

Hb F在許多血液系統疾病中都表現為升高，包括地中海貧血、鐮刀型細胞貧血、遺傳性Hb F持續增多癥、骨髓異常增生等疾病［9］。而早在上世紀七十年代人們就開始注意到惡性腫瘤Hb F表達量的增加，現已證明許多惡性腫瘤尤其是胚胎惡性腫瘤，血液系統腫瘤和大腸癌，其 表達量呈明顯增加［10］。因此，Hb F的定量檢測對于這些疾病的診斷和預防發揮著越來越大的作用。目前，國外商品化試劑盒多采用雙多抗夾心ELISA，特異性稍差，且為進口試劑盒，價格昂貴［4］。本實驗所建立的單多抗ELISA檢測體系特異性強，重復性好，有望應用于以后的臨床檢測和基礎研究。

［1］Jerusalem，Israel.Flow cytometric analysis of fetal hemoglobin in erythroid precursors of b－thalassemia［J］.Clin Lab Haem，2004，26：187.

［2］M Wolk，JE Martin and M Nowicki.Foetal haemoglobin－blood cells（F－cells）as a feature of embryonic tumours（blastomas）［J］.British Journal of Cancer，2007，97，412.

［3］Pelle G，Lindqvist，Peter Gren.An easy－to－use method for detecting fetal hemoglobin－A test to identify bleeding from vasa previa［J］.European Journal of Obstetrics ＆ Gynecology and Reproductive Biology，2007，131（2）：151.

［4］程 偉，富 寧.人胎兒血紅蛋白的檢測及其臨床意義［J］.中國實驗診斷學，2009，（10）.

［5］程 偉，劉艷君，陳遠東，鐘 梅，富 寧.抗胎兒血紅蛋白單克隆抗體的制備及特性鑒定［J］.中國實驗診斷學，2009，（02）.

［6］江海燕，劉艷君，朱 平，韓強濤，富 寧.人可溶性CD14檢測體系的建立［J］.中國實驗診斷學，2004，（01）.

［7］Wajcman H，Galactéros F，Hanichi A，Yapo A，Préhu C.Hb F in the adult：could its composition discriminate normal from abnormal foetal globin gene expression？［J］.C R Acad SciⅢ，2000 Nov；323（11）：975.

［8］Urszula Wojda，Pierre Noel and Jeffery L.Miller.Fetal and adult hemoglobin production during adult erythropoiesis：coordinate expression correlates with cell proliferation［J］.Blood，2002，99：3005.

［9］Atweh GF，Desimone J，Saunthararajha Y，Fathallah H，Weinberg RS，Nagel RL，Farby ME，Adams RJ.Hemoglobinopathies［J］.Hematology（Am Soc Hematol Educ Program），2003，14.

［10］Wolk M，Martin JE.Fetal haemoglobin（Hb F）as an immunohistochemical tumour marker in bone marrow and spleen.J Clin Pathol.2011 Jul；64（7）：645.