Tn5及其應用研究進展

徐廣宇，魏成國，馬金姝，張曉天，王 放＊

（1.吉林大學白求恩醫學院 病原生物學教研室，吉林 長春 130021；2.北華大學藥學院，吉林 吉林 132013）

轉座子是基因組中一段可移動的DNA序列，可以通過切割、重新整合等一系列過程從基因組的一個位置“跳躍”到另一個位置［1］。Barbara Mc－Clintock［2，3］根據大量遺傳學和細胞學研究結果，于1951年提出了生物的基因組中存在轉座子學說，這是遺傳學發展史中劃時代的重大發現，將基因概念向前推進了一大步。近年來，隨著現代分子生物學技術的發展及基因功能研究的不斷深入，轉座子技術的應用越來越廣泛。Transposon 5（Tn5）由于其轉座的隨機性好、穩定性高、插入位點容易測序等特點，得到越來越多的應用，已經成為分子遺傳學及基因診斷學研究的熱門工具［4，5］。本文主要對Tn5的基本結構、轉座機制及其在必需基因、蛋白質結構功能、基因測序方面的應用研究進展作一綜述。

1 Tn5簡介

1.1 Tn5的基本結構

Tn5是復合轉座子，由一個中心區域和二個側翼序列組成。中心區域含有3個抗生素抗性基因，包括卡那霉素（kanamycin）、鏈霉素（streptomycin）和博萊霉素（bleomycin），中心區域的兩側的側翼序列IS是一種自主性的轉座因子。位于Tn5右側的IS50R編碼含有476個氨基酸的轉座酶（transposase，tnp）和一個轉座阻遏蛋白（inhibitor protein，Inh），這兩種蛋白質都由同一段DNA序列編碼；Tn5左側的IS50L與右側的IS50R只是一對堿基的差別，IS50L上存在一個突變序列，可以使翻譯提前終止，不能產生有活性的轉座酶和轉座阻遏蛋白［6］。每個IS50轉座元件的兩端有長度19 bp的outside end（OE）和inside end（IE）末端序列，OE是轉座酶的結合位點（圖1）。

1.2 Tn5的轉座機制

1.2.1 Tn5的轉座過程 Tn5的轉座屬于非復制型轉座。在轉座過程中，Tn5轉座酶單體先綁定到Tn5末端OE上的結合位點，并且連接供體DNA形成復合體；形成聯會復合體后，在某種條件下（熱刺激或者陽離子存在）Tn5轉座酶具有切割DNA的活性，使Tn5從復合物中釋放；離開復合體后Tn5隨機插入到目的DNA上，插入位點的9 bp序列的兩條鏈會分開，并分別連接在Tn5的兩端形成粘性末端（圖2）；最后在DNA聚合酶的作用下補平缺口，轉座子的兩端形成9 bp 的正向重復序列［6，7］。

圖1 Tn5的基本結構

圖2 Tn5插入位點的復制

1.2.2 Tn5轉座位點的確認 Tn5轉座元件IS50的末端有一段長19bp的序列，我們跟據此序列設計特定引物，然后使用反向PCR法對Tn5插入位點的DNA序列進行擴增（圖3），測序后通過BLAST系統就可以得到Tn5插入基因的序列［8］。

圖3 Tn5插入位點的確定

2 Tn5的應用研究進展

2.1 Tn5在必需基因方面的研究進展

維持某種生物細胞生長所必需的基因被稱為是這個生物的必需基因［9］。轉座子可以對基因進行調控，是因為轉座子插入后會引起插入位點所在基因失活。如果插入的基因是必需基因，則該細菌死亡，不能生成菌落；如果插入的是非必需基因，則可能影響該基因的表達，但不影響該細菌的生長，生成菌落，因此我們可以通過轉座子篩選出非必需基因。

由于Tn5的轉座隨機性更高，穩定性更好，并且插入位點更容易確認，因而發現必需基因的幾率更高，更準確。S.Y.Gerdes［10］等通過Tn5構建的遺傳印記技術，發現大腸桿菌MG1655的遺傳物質中存在大量轉座進化形成的REP序列，在4291個蛋白編碼基因中，篩選出3746個基因，其中包括620個必需基因和3126個非必需基因。Byung Jo Yu和Sun Chang Kim［11］等在大腸桿菌中通過Tn5構建的Cre／loxP重組系統，利用Tn5高效隨機插入和卡那霉素抗性基因產生的突變菌庫，篩選出大量的非必需基因，進而找到篩選必需基因的可行性。Severine［12］等在豬布魯士菌中使用Tn5建立相關鼠科模型，通過研究發現norD基因不僅編碼與豬布魯士菌毒性密切相關的一氧化氮還原酶，而且也是豬布魯士菌的必需基因。

我們可以通過Tn5對一些病原體必需基因的研究，開發潛在的藥物作用靶點，更加有效地治療疾?。?3，14］。肺炎克雷伯菌是一個眾所周知的條件致病菌，在呼吸道感染的早期階段可能與其生物膜的形成有關，Heather F［15］等通過mini－Tn5突變體庫的構建，研究了在體外生物膜形成和體內肺炎克雷伯菌感染之間的關系，并且找到相關的基因；Stahlhut SG［16，17］等通過Tn5產生的隨機突變，分離肺炎克雷伯菌臨床株C3091的生物膜基因并構建克隆質粒在大腸桿菌中表達，共篩選出1152個能增強生物膜特性的克隆體，其中9個克隆體能顯著增強生物膜的特性，5個克隆體包含眾所周知的與肺炎克雷伯菌毒力因子和生物膜相關的類型3鞭毛基因。

我們還可以通過對某些病原體必需基因的鑒定，而使其成為診斷該疾病的標準。Sakamoto H［18］等在原核病原生物瘧原蟲的研究中發現，很多轉座子在瘧原蟲中轉座效率很低，而從大腸桿菌中分離并重新構建的Tn5的衍生物mini－Tn5具有很高的轉座效率，因此通過構建mini－Tn5轉座穿梭突變，建立了通過必需基因診斷瘧原蟲病的方法。

2.2 Tn5在蛋白質方面的研究進展

近年來，隨著分子生物學及轉座子技術的廣泛應用，轉座子逐漸成為蛋白質功能研究的重要工具。通過轉座子的隨機插入，可以找到相關功能的開放閱讀框架，進而影響相關的基因表達，即對蛋白質功能進行研究［19］。

Tn5在蛋白質結構功能方面的研究主要體現在通過Tn5的高效隨機插入，由Tn5上攜帶的已知基因和未知目的基因產生融合蛋白，因為隨機插入的目的基因不同，產生的融合蛋白也不相同，通過對不同融合蛋白的研究就能發現相關的目的基因以及相應的轉座子系統。兔熱病桿菌是一種能感染人類淋巴系統的病原體，為了對這個病原體進行遺傳分析，Blake W.［20］等建立了一個溫度敏感的以Tn5為基礎的轉座子系統，通過活躍的轉座酶的催化作用，找到能夠產生與LacZ基因或luxCDABE基因相關的染色體報告融合蛋白，并能夠監測基因表達的能力，從而建立了兔熱病桿菌毒力相關基因的一個新的轉座子系統。James A.［21］等通過Tn5構建了的輔助基因轉座子插入技術（Transposon Assis ted Gene Insertion Technology，TAGIT），通過輔助基因轉座子插入技術把綠色熒光蛋白基因（green fluorescent protein，GFP）隨機插入到染色體位點上，但不破壞其操縱子結構，然后對綠色熒光蛋白進行追蹤分析，最終有可以得到有用的部分功能的靶蛋白。

Tn5在蛋白質功能方面研究的應用還通過其衍生物Tnpho A進行［22，23］。當 Tn－pho A 隨機插入目 的 DNA 時，有缺陷的pho A的羧基端肽段可能融合到目的蛋白的氨基端肽段上，并在目的基因和pho A之間產生正確的閱讀框架，結果可產生融合蛋白。Tn－pho A在研究蛋白方面有許多應用：1.檢測蛋白的表達并定位蛋白；2.通過隨機插入目的DNA，找到新的編碼跨膜蛋白或細胞周間質蛋白的基因。在研究原核生物病原體特定輸出信號中，Matthew［24］等通過構建mini－Tn5 pho A方法在輸出蛋白和pho A基因中產生融合蛋白，以此來分離特殊輸出信號，并且由實驗驗證表明，結核分支桿菌4種分泌蛋白能夠攜帶敏感信號Tat，因此表明Tat是重要的與人類疾病相關的致病因素。

2.3 Tn5在基因測序的應用

基因測序，即測定DNA序列。目前用于測序的技術主要有Sanger等（1977）發明的雙脫氧鏈末端終止法和 Maxam和Gilbert（1977）發明的化學降解法。這兩種方法不僅測序的時間長，而且過程繁瑣。1994年Sootte等利用構建人工轉座子，在原有測序技術的基礎上發展了一種快速簡便的DNA的測序方法。Tn5在基因測序方面的應用是最近的研究熱點，Tn5的插入是一個隨機性很高的過程，當Tn5轉座后，先利用攜帶的抗性基因進行陽性篩選，然后使用轉座子兩端的特異序列構建引物，通過引物對陽性克隆進行PCR擴增，然后進行測序，最后通過計算機對擴增的序列進行分析，進而得到完整的序列信息。用Tn5轉座子進行測序不僅快速，而且準確。

一般轉座子對目標DNA插入是有一定位點的選擇性，但Tn5對于目標DNA的插入選擇基本完全隨機，因此其在基因測序方面的應用非常廣泛。Tn5轉座子用于測序有以下幾個優點：（1）形成大量的轉座突變體，可以同時測序，使測序更快捷便利；（2）可以在Tn5上加入一些修飾基因，使測序更方便。

3 展望

隨著遺傳學及分子生物學的不斷發展，轉座子技術的應用也越來越廣泛。Tn5由于其隨機性好，轉座后穩定，轉座頻率高，易于篩選等一系列優點，成為了研究基因、蛋白質功能和測序的有效工具，并且在疾病診斷、基因治療、免疫功能研究等方面顯示了良好的前景。但Tn5也有一些不足，如雖然Tn5的轉座隨機性很高，但仍有一些熱點冷點存在；Tn5轉座酶活性的高低影響了Tn5的轉座效率等。此外，Tn5在微生物、植物、動物乃至人類的基因功能研究中都發揮著重要的作用，隨著研究的深入，Tn5的應用也會更廣泛，人們對基因功能的認識也將會更加全面。

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