神經生長因子對大鼠腦缺血再灌注損傷的神經保護

汪志峰,張 毅,馬寶君,虞 昊

(南通大學第二附屬醫院,1.神經外科;2.心胸外科,江蘇南通,226001)

神經生長因子(NGF)是人類發現的第一個神經營養因子家族成員,也是最重要的一個因子,其在神經細胞體外培養模型中能提高培養神經元的活性,表現出良好的保護受損神經元,促進神經元生長的作用[1]。本研究通過觀察NGF對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后氧自由基、炎性細胞因子和神經元凋亡的影響,研究NGF對腦缺血后的神經保護作用機制,為進一步應用于臨床提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雄性清潔級SD大鼠共36只,體重250～300g,由南通大學實驗動物中心提供,實驗動物生產許可證號:SCXK(蘇)2001-0011。凱基原位末端標記(TUNEL)細胞凋亡原位檢測試劑盒(BIOTIN標記POD法,石蠟切片專用);考馬氏亮蘭蛋白試劑盒(南京建成生物工程研究所);超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所);雙抗體夾心酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組:36只大鼠隨機分成3組,即假手術(Sham)組、缺血再灌注損傷(IR)組、NGF治療組,每組12只。Sham組:麻醉及手術同IR組,只暴露右側頸總動脈而不做其他操作; IR組:阻斷右側大腦中動脈120 min后開放,不做其他操作;NGF組:同樣阻斷大腦中動脈120 min,然后在開放的即刻肌注NGF 1 000 U(2 mL生理鹽水溶解),假手術組和腦缺血組肌注等量生理鹽水。

1.2.2 實驗動物模型制作:參考Longa線栓法[2]制作大鼠右側大腦中動脈可逆性閉塞模型。采用動物的神經功能缺損評分(NDS)作為模型成功與否標準。大鼠麻醉完全清醒后,于再灌注2 h時進行NDS。評分為0分和4分的大鼠予以剔除。保證每組12只不變,隨機補充。

1.3 觀察指標

再灌注24 h后,從各組大鼠中隨機取6只,切取右側大腦半球,制成10%腦組織勻漿,3 000 r/min低溫離心10 min,取上清液測定蛋白含量。參照試劑盒說明行腫瘤壞死因子－ α(TNF－ α)、白介素－1β(IL－1β)、IL－6、SOD、MDA的測定。恢復再灌注24 h后,每組剩余6只大鼠,切取前聯合水平冠狀面厚約2 mm腦片組織,制成石蠟切片,用TUNEL法檢測凋亡神經細胞。檢測程序按試劑盒操作說明進行。

2 結 果

2.1 大鼠腦組織勻漿中SOD和MDA的變化

SOD活性在 IR組最低,Sham組最高。與IR組相比,NGF組SOD活性明顯升高,差異有統計學意義(P<0.01)。MDA含量檢測發現,再灌注24 h腦組織均漿中MDA含量在IR組最高, Sham組最低。與IR組相比,NGF組MDA含量明顯下降,差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 大鼠腦組織中SOD、MDA的變化(±s)

表1 大鼠腦組織中SOD、MDA的變化(±s)

組別 n SOD(nU/mL) MDA(nmol/mL) Sham組 6 207.93±15.09 0.91±0.18 IR組 6 126.94±8.61 2.72±0.39 NGF組 6 157.05±10.4433 1.86±0.2933

2.2 大鼠腦組織均漿中TNF －α、IL－1β、IL－6的變化

再灌注24 h腦組織均漿中TNF－ α、IL－1β、IL－ 6在IR組均最高,Sham均最低。與 IR組相比, NGF組TNF－a、IL－lβ水平明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05)。與IR組相比,NGF組IL－6水平明顯降低,差異有統計學意義(P<0.01)。見表2。

表1 大鼠腦組織中TNF－ α、IL－lβ、IL－6、凋亡細胞數的變化(±s)

表1 大鼠腦組織中TNF－ α、IL－lβ、IL－6、凋亡細胞數的變化(±s)

與IR組比較,3P<0.05,33P<0.01

組別 n TNF－ α(ng/mL) IL－1β(ng/mL) IL－6(pg/mL) 凋亡細胞數(個/400倍) Sham組 6 0.61±0.12 100.15±12.20 63.48±8.84 3.13±0.56 IR組 6 1.28±0.27 170.56±18.18 121.63±13.03 51.98±4.13 NGF組 6 0.97±0.173 147.86±14.603 98.57±11.0833 41.91±5.7133

3 討 論

NGF是機體產生的能夠促進神經細胞存活、生長、分化的一種多肽。它不僅具有中樞神經營養作用,而且能夠促進神經元的再生,改善神經元的病理狀態,對缺血缺氧后神經損傷具有重要的保護和修復作用[3]。在腦缺血性損傷中,NGF對減輕神經元損傷和增強損傷修復、提高存活率有其重要作用。其作用機制[4-5]包括:①提高過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化酶的活性,清除氧自由基,減輕神經元損傷;②拮抗谷氨酸等興奮性氨基酸的腦毒性作用;③穩定神經元胞漿內Ca2+水平,從而保護損傷神經元;④調節凋亡基因的表達,抑制神經細胞凋亡,對缺血后神經元具有保護作用。此外本實驗研究顯示,NGF可抑制腦缺血再灌注后與炎癥相關的多種細胞因子的表達,從而抑制這些炎性因子的“炎性瀑布”效應,減輕炎癥反應,減輕腦組織損傷。這為NGF保護腦缺血再灌注損傷的機制又補充了一種新的解釋[6]。

腦缺血時,可刺激大腦皮層及海馬結構中內源性NGF表達增加,但維持時間短暫,增加幅度有限,不能對受損神經元起到全面、持久的保護作用。因此人們很自然地想到了補充外源性NGF以減少神經細胞的損害。以往認為NGF是大分子多肽,不能通過血腦屏障,一般通過側腦室給藥,該用法在臨床實際應用有一定難度。近年來研究[7]顯示通過外周注射NGF也可以完整透過血腦屏障,有學者將NGF標記后肌注給藥,在腦內檢測到有NGF的分布。其機制[8]可能為:①缺血后血-腦屏障不可避免遭到破壞,從而使NG能直接透過血-腦屏障,進入腦組織中發揮腦保護作用;②其他特殊的轉運機制:中樞神經系統存在血-腦屏障旁路,能以胞吞方式轉運大分子物質,主要經腦室的脈絡叢和內皮細胞等部位進行。

綜上所述,NGF對大鼠局灶性缺血再灌注損傷有保護作用。保護作用表現為減少腦缺血再灌注組織中炎性細胞因子 TNF－ α、IL－1β、IL－6的合成和釋放,改善氧自由基代謝,減輕大腦神經細胞的凋亡等多個方面。雖然NGF在動物實驗研究中展示了良好的神經保護作用,但在臨床應用中并未取得預期的效果。下一步要繼續研究NGF的最佳用藥時機、劑量、給藥方式、給藥次數、療程等。此外,腦缺血再灌注損傷是一個復雜的病理生理過程,單一治療方法必定難以奏效。針對損傷各環節的不同機制,聯合運用不同的藥物治療、細胞因子治療、基因治療、中醫藥治療、物理治療等多種方法,從而提高缺血性腦血管疾病的療效,是今后有待進一步深入研究的方向。

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