Periostin基因多態(tài)性與蘇皖漢族人群冠心病發(fā)病的初步研究

周學(xué)軍,紀(jì) 元,蔣建光,劉志平,王芳芳,丁志堅(jiān)

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院心內(nèi)科,江蘇常州,213000)

目前,冠心病(CAD)已成為人群死亡的主要疾病,闡明其發(fā)病機(jī)理并確定風(fēng)險(xiǎn)人群,成為社會(huì)的一大醫(yī)療挑戰(zhàn)。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)因?qū)ρ艿恼{(diào)節(jié)作用在粥樣斑塊的增長(zhǎng)以及不穩(wěn)定斑塊的形成中起重要作用,其影響主要通過它的特異性受體(KDR)傳送[1-3]。因此,VEGF/KDR信號(hào)通路的調(diào)控,在血管生成和修復(fù)及冠心病的發(fā)生發(fā)展方面起著重要作用[4]。2007年,王一波等[5]研究發(fā)現(xiàn),攜帶 KDR突變的人群更容易受到冠心病的侵害,并提示較高的冠心病危險(xiǎn)可能是VEGF/KDR信號(hào)通路的下調(diào)導(dǎo)致。Periostin (POSTN)是屬于fasciclin分子家庭的一種細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白,具有細(xì)胞黏附、遷移和分化作用[6]。Bagnato等[7]發(fā)現(xiàn)POSTN蛋白在血管內(nèi)膜的生長(zhǎng)和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展中發(fā)揮著有效的作用。另有一些研究表明[8-9],POSTN能調(diào)控乳腺癌細(xì)胞與人類毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的 KDR表達(dá)。因此,我們推測(cè)POSTN多態(tài)性可能通過調(diào)節(jié)VEGF/KDR信號(hào)通路與冠心病易感性相關(guān),并對(duì)POSTN基因多態(tài)性與蘇皖漢族人群冠心病發(fā)病的關(guān)系進(jìn)行了研究,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

將本院住院患者554例作為冠心病組,其中男338例,女216例,平均年齡(65.75±13.24)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)至少有1支主要冠狀動(dòng)脈狹窄50%以上,其中59.2%為心肌梗死患者。另選同期醫(yī)院體檢的正常人群687例作為對(duì)照組,其中男377例,女310例,平均年齡(63.03±13.64)歲。心電圖、胸片、腹部超聲及肝腎功能均正常,排除心力衰竭、周圍血管疾病、瓣膜病、風(fēng)心病、肺心病、腫瘤、結(jié)締組織、骨折以及其他與POSTN相關(guān)疾病。2組人群均為蘇皖地區(qū)漢族人,無血緣關(guān)系,且均對(duì)檢測(cè)知情同意。

1.2 主要儀器和試劑

AU2700全自動(dòng)生化分析儀(OL YMPUS), PCR擴(kuò)增儀(Biometra2TGRADIENT),UVI自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio2Rad,Quan ity one), TaqDNA聚合酶(TaKaRa)、dNTPs(單脫氧核糖核酸混合物)(TaKaRa)、上下游引物(TaKaRa)、限制性內(nèi)切酶(New England Biolabs)。

1.3 方法

1.3.1 詢問一般情況:詳細(xì)詢問每人的疾病史、家族史、個(gè)人史、吸煙飲酒史、身高、體重和血壓等人群基線資料,并做好記錄。

1.3.2 血標(biāo)本采集:所有研究對(duì)象均在禁食12h后,于清晨采肘靜脈血2 mL,32 g/L枸櫞酸鈉抗凝,分離血漿和白細(xì)胞,-70℃保存,備用。記錄填寫冠心病患者資料表并附出院小結(jié)一份。

1.3.3 基因組DNA的提取:采用酚-氯仿法提取白細(xì)胞基因組DNA,加入4 0μL TE保存(10 mmol/L Tris2HCl,1 mmol/L EDTA,pH 8. 0),-70℃保存。

1.3.4 POSTN基因SNP位點(diǎn)的選取:啟動(dòng)子區(qū)的POSTN SNP A2953T位點(diǎn)因?yàn)閷?duì)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的潛在影響被選中。這個(gè)位點(diǎn)可能通過調(diào)控血管生長(zhǎng)影響乳腺癌發(fā)生發(fā)展;此外,dbSNP數(shù)據(jù)庫顯示,這個(gè)單核苷酸多態(tài)性在中國人群中存在;而且,我們進(jìn)行的小樣本預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示,這個(gè)單核苷酸多態(tài)性在我們研究的人群中存在。

1.3.5 PCR擴(kuò)增:引物由大連寶生物工程有限公司合成,上游引物為5′2CCCTCTAAGATA2 CAAAGGAA23′;下游引物為 5′2CCTGATAC2 GACTATGAGCC23′。PCR反應(yīng)體系為50μL,包括 :1 0×緩沖液5μL,Mg2+終濃度為2.0 mmol/L,4種dNTP終濃度為0.2 mmol/L,上下游引物各 20 pmol,Taq DNA酶 1.25 U (TaKaRa)和DNA模板100 ng。PCR反應(yīng)條件: 9 4℃預(yù)變性5 min,然后按9 4℃6 0 s,5 8℃50 s,72℃60 s進(jìn)行30個(gè)循環(huán),終末延伸72℃5 min。

1.3.6 限制性內(nèi)切酶酶切、電泳及測(cè)序:取5μL PCR產(chǎn)物用5 U限制性內(nèi)切酶SspI于37℃溫育12 h,產(chǎn)物經(jīng)30 g/L瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像系統(tǒng)判斷基因型。基因型分為AA純合型(221 bp);AT雜合型(175,143和33bp)和TT純合型(142和33 bp)。部分PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)一步測(cè)序鑒定。

2 結(jié) 果

2.1 臨床資料

與對(duì)照組相比,冠心病組有更多的老年人(P<0.0 1)、男性(P<0.0 5)、高血壓者(P<0.01)、吸煙者(P<0.01)或糖尿病者(P<0.01);血漿甘油三酯(TG)(P<0.01)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL2C)(P<0.01)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL2C)(P<0.01)水平冠心病組與對(duì)照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 2組臨床資料比較

2.2 基因型分布

對(duì)照組基因型頻率遵循Hardy2Weinberg平衡(χ2=0.033,P=0.857),具有群體代表性。POSTN A2953T基因型分布:冠心病患者(AA型275例,AT型202例,TT型16例),正常人群(AA型368例,AT型266例,TT型31例), 2組分布無顯著性差異(χ2=1.982,df=3, P=0.576)。T等位基因(T allele)頻率兩組分布無顯著性差異(P=0.122)。見表2、圖1。優(yōu)化后的logistic回歸模型包含年齡、性別、HDL2C、LDL2C、TG、吸煙狀況、糖尿病和高血壓的患病狀況。Hosmer and Lemeshow檢驗(yàn)P值為0.0 0 5 (χ2=22.206,df=8)。

表2 POSTN基因型分布比較[n(%)]

圖1 POSTN A2953T基因型

3 討 論

POSTN蛋白最初于 1993年由日本學(xué)者Takeshita等從小鼠成骨細(xì)胞株中克隆成功,分子量為90 KD,由838個(gè)氨基酸組成,是由心臟成纖維細(xì)胞分泌表達(dá)的一種ECM蛋白。POSTN基因定位于人類染色體13q13.3區(qū)域,長(zhǎng)度為3 213 bp,編碼838個(gè)氨基酸,是心腦血管病的重要候選基因。

POSTN SNP A2953T位點(diǎn)位于啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)。轉(zhuǎn)錄子數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)(TESS)顯示,A2953T SNP T等位基因可形成了一個(gè)假定的c2myb基因和GA2 TA21轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn),而A等位基因可形成了一個(gè)假定的 SOX25轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),因此, POSTN A2953T SNP突變可導(dǎo)致啟動(dòng)子區(qū)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用發(fā)生變化,從而影響POSTN蛋白的合成。Forsti等[9]已證實(shí),這個(gè)位點(diǎn)可能通過調(diào)控血管生長(zhǎng)影響乳腺癌發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。

POSTN與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系,已經(jīng)得到許多實(shí)驗(yàn)的證實(shí)。Lindner等[10]發(fā)現(xiàn),在大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型中,損傷動(dòng)脈血管內(nèi)膜中POSTN的mRNA和蛋白表達(dá)量明顯上調(diào)。另外實(shí)驗(yàn)表明[11],大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞在低氧應(yīng)激反應(yīng)下(一種類似動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病過程的病理狀態(tài)),POSTN分泌水平明顯上調(diào)。此外,在乳腺癌人群中,POSTN表達(dá)與血管生成密切相關(guān)[8]。因此,推測(cè) POSTN可能通過調(diào)節(jié)VEGF/KDR信號(hào)通路與冠心病易感性相關(guān)。

本項(xiàng)研究首次證實(shí)POSTN A2953T位點(diǎn)TT基因型在中國人群中存在,填補(bǔ)了 HAPMAP HCB數(shù)據(jù)庫的空白。同時(shí)證實(shí)POSTN基因A2 953T位點(diǎn)多態(tài)性分布在本項(xiàng)研究人群中的存在,分布頻率基本與HAPMAP HCB數(shù)據(jù)庫相符。

但在本項(xiàng)研究中,POSTN基因的多態(tài)性未發(fā)現(xiàn)與CAD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)明顯相關(guān)。可能以下因素有關(guān):首先,不同的種族差異導(dǎo)致不同的遺傳差異,POSTN與動(dòng)脈粥樣硬化的研究大多為國外人群研究,漢族人群研究較少,在本研究中國人群未發(fā)現(xiàn)POSTN基因多態(tài)性與CAD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān),不代表國外人群情況;其次,POSTN A2953T位點(diǎn)TT基因型在中國人群分布頻率較低,可能影響統(tǒng)計(jì)效率;此外,本研究只對(duì)POSTN基因啟動(dòng)子區(qū)的一個(gè)功能性位點(diǎn)進(jìn)行了研究,可能其他一些基因多態(tài)性位點(diǎn)與CAD或其他心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān);另外,POSTN基因變異對(duì)冠心病的作用,可能與環(huán)境因素和其他基因的交互作用有關(guān);當(dāng)然,也有可能POSTN存在于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中只是一個(gè)偶然現(xiàn)象,而不直接參與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的病理活動(dòng)。這些都需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量,進(jìn)行不同人群重復(fù)試驗(yàn)。

本研究證實(shí),POSTN A2953T位點(diǎn)TT基因型在中國人群中存在,POSTN基因A2953T位點(diǎn)多態(tài)性分布中國人群中存在,補(bǔ)充了POSTN基因多態(tài)性的數(shù)據(jù)庫信息;但POSTN基因多態(tài)性與中國人群冠心病發(fā)病危險(xiǎn)未發(fā)現(xiàn)明顯相關(guān)。該研究結(jié)果尚需進(jìn)行更大樣本的前瞻性重復(fù)性研究。

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