羅格列酮對小鼠急性肝衰竭保護作用的實驗研究

司徒小紅

本研究通過D-GalN聯合LPS腹腔注射構建小鼠急性肝衰竭模型，探討其誘導急性肝衰竭的可能機制;并以羅格列酮干預，觀察小鼠24h存活率、肝組織的病理改變、肝臟酶學水平以及肝組織中TNF-α、TGF-β1的表達，觀察羅格列酮對急性肝衰竭是否有保護作用，并研究其可能的作用機制。

材料與方法

1.研究對象 昆明小鼠:6～8周齡，雄性，清潔級，體重2鮑左右，購自南方醫科大學動物實驗中心，實驗前適應性預養一周。

2.主要試劑材料:細菌脂多糖(LPs)，美國Sigma公司;D-氨基半乳糖，重慶醫科大學生物醫學工程研究室;馬來酸羅格列酮片，葛蘭素一史克制藥公司。

3.主要儀器:全自動紫外分光光度計，美國Beckman公司;電子天平，上海第二天平廠;低溫高速離心機，美國PE公司;-70℃立式超低溫冰箱，上海天能科技有限公司;全自動生化分析儀，日本sanyo公司;170℃高溫烤箱，北京六一儀器廠。

4.構建小鼠急性肝衰竭模型:雄性昆明小鼠100只，隨機分為5組，每組分別以 D-GalN 400 mg/kg聯合LPS 10 U/kg，D-GalN 500 mg/kg聯合LpS 10 μg/kg，D-GalN 600 mg/kg 聯合 LPS 10 U/kg，D-GalN 700 mg/kg 聯合 LPS 10 μg/kg 腹腔注射，正常組以生理鹽水腹腔注射，觀察各組小鼠24h存活率。

5.羅格列酮干預:雄性昆明小鼠60只，隨機分為A、B、C3組，每組20只，選擇羅格列酮20 mg/kg作為治療劑量。A組為正常組，B組為對照組，C組為羅格列酮治療組。B組和c組分別予以D-GalN 600 mg/kg聯合LPS 10 μg/kg腹腔注射構建小鼠急性肝衰竭模型，c組于造模前2h以羅格列酮20 mg/kg灌胃，B組相應在造模前2h以生理鹽水灌胃;A組均在相應時間點予以生理鹽水灌胃及腹腔注射。造模后6h，每組隨機選擇5只小鼠去眼球采血，血標木于37℃水浴半小時后以3000 r/min離心10分鐘，取血清保存于-70℃冰箱中，用于待測血清轉氨酶;再隨機選擇5只小鼠斷頸處死，無菌取約100mg肝組織置于去酶EP管中并保存于速凍液氮內，再轉存于-70℃冰箱，以待提取總RNA;另取小塊肝組織于10%中性磷酸緩沖福爾馬林液中固定，用于HE染色。

6.血清轉氨酶的檢測:采用全自動生化分析儀測定丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)。

結 果

1.不同劑量羅格列酮對D-GalN/LPS小鼠24h存活率的影響見表1。

表1 不同劑量羅格列酮對D-GalN/LPS小鼠24h存活率的影響

2.羅格列酮對D-GaIN/LPS小鼠血清轉氮酶的影響由表2可見，正常組小鼠血清轉氨酶ALT水平為(47.4±6.3)U/L、AST 水平為(62.8 ±5.7)U/L，對照組小鼠血清轉氨酶ALT水平為(3664.8±646.1)U/L、AST 水平為(3514.0 ±468.9)U/L，羅格列酮治療組小鼠血清轉氨酶ALT水平為(403.6±76.1)U/L、AST 水平為(464.6 ±63.0)U/L。對照組ALT和AST水平均顯著高于正常組，而治療組ALT和AST水平較對照組顯著降低(P＜0.05)。

表2 羅格列酮對D-GaIN/LPS小鼠血清轉氮酶的影響

討 論

急性肝衰竭來勢兇猛采取積極、有效的措施阻止病情的迅速進展是治療的關鍵所在，這就需要我們更好地了解疾病發生的細胞、分子、蛋白和基因等方面的機制。開發、驗證新的治療方法，除了通過臨床研究對人類患者直接觀察外，采用動物模型開展實驗研究己成為科研攻關不可缺少的手段之一。建立一個成功的急性肝衰竭動物模型，對研究其機理、驗證療效有著非常重要的意義［1］。結果表明，正常組小鼠肝組織僅有少量TNF-α mRNA的表達，對照組肝組織中TNF-α mRNA的表達較正常組顯著增強，并與肝細胞炎癥壞死程度呈正相關，說明TNF-α和肝細胞壞死有著非常密切的關系，進一步推測D-GalN/LPS可能通過上調TNF-α的表達而導致肝細胞炎癥壞死乃至急性肝衰竭。大量的實驗已證實在急性肝衰竭中，除了細胞炎癥壞死這一死亡形式外，也存在著細胞凋亡。絕大多數的細胞凋亡依賴于caspase的激活，Caspase是一種半胱氨酸蛋白酶，半胱氨酸殘基是其催化活性所必需的，目前己鑒定的哺乳動物caspase有14種，在細胞凋亡的執行期發揮關鍵作用，并與凋亡的形態學特征密切相關。正常情況下細胞內caspase與其抑制劑總是共存的，以免CasPase酶原被意外激活對正常細胞造成損傷。而活化的Caspase能夠特異性的水解蛋白底物，從而導致細胞凋亡。因其在凋亡過程中的重要作用，有人認為caspase是凋亡的執行者，亦有人將其譽為“凋亡步兵”或“凋亡劊子手”。

基于羅格列酮具有抗炎、抗氧化和抗凋亡等作用，而急性肝衰竭與肝細胞的炎癥、壞死及凋亡有密切關系，故羅格列酮是否也可用于急性肝衰竭的治療，目前國內外尚未見相關報道［2］。本實驗通過羅格列酮干預小鼠急性肝衰竭模型，觀察其對急性肝衰竭是否有保護作用。本研究發現羅格列酮可明顯降低小鼠急性肝衰竭的24小時死亡率，與對照組比較，死亡率下降40個百分點，差異有顯著性。

總之，肝衰竭的發病機制及其復雜，至今尚未找到一種能阻止肝衰竭進展的特效藥物［3］。正因如此，緊密結合臨床到深入的實驗研究，探索肝衰竭的發病機制，并據其發病機制研發更有效的防治手段是肝衰竭發病機制研究及治療發展的方向，具有重大意義及廣闊的前景。目前國內外未見關于羅格列酮治療急性肝衰竭以及其作用機制的研究報道，故將此研究進一步完善和深入，將為急性肝衰竭的臨床研究和藥物開發提供一個新的方向［4］。

D-GalN 600 mg/kg聯合 LPs l0 μg/Kg腹腔注射成功構建了小鼠急性肝衰竭模型;其可能通過上調TNF-α、TGF-β1的表達導致急性肝衰竭。羅格列酮對D-GalN/LPS小鼠急性肝衰竭有明顯的保護作用，可改善肝細胞炎癥和壞死，降低急性肝衰竭的死亡率，其機制可能與羅格列酮下調TNF-α、TGF-βl的表達有關。

1 陳立平，周巧玲，歐陽春，等.羅格列酮對糖尿病腎病大鼠足細胞nephrin和 podocin表達的影響?J?.中華腎臟病雜志，2007，23(4):263-264.

2 Panchapakesan U，Pollock CA，Chen XM.The effeet of PPAR-gamma agonists on PPAR-gamma expression and function in HK-2 cells?J?.Am J Physiol，2004，287(3):528-534.

3 劉章鎖，牛紅心，程根陽，等.羅格列酮對糖尿病大鼠腎保護機制的研究評論?J?.中華腎臟病雜志，2004，20(2):109-112.

4 林茂松，陳衛昌，白霞.羅格列酮對大腸癌細胞生長影響的研究?J?.蘇州大學學報，2005，25(2):197-200.