Ezrin與 NF-κBp65、ICAM-1在胃癌組織及區域轉移淋巴結中的表達及意義

張文軍 楊洪穎 申策 李茂恒 鄭宏江 左燕紅

胃癌在轉移進展過程中將出現異質性(Heterogeneity)變化，導致腫瘤細胞的侵襲、轉移、耐藥性等與原發灶不同［1－3］。了解胃癌轉移組織中腫瘤細胞的特征對探討胃癌侵襲轉移規律有重要意義，但目前有關胃癌轉移灶腫瘤細胞侵襲轉移情況的報道還很少見。埃茲(Ezrin)基因是新近發現的與多種惡性腫瘤關系密切的新基因，可促進多種惡性腫瘤的侵襲和轉移［4，5］。因此，本研究檢測了Ezrin蛋白在胃癌及區域轉移淋巴結中的表達情況，并對其意義進行了分析。為了解Ezrin蛋白在胃癌侵襲轉移中的作用機制，本研究同時檢測了細胞核轉錄因子(NF-κB)p65、細胞間黏附因子-1(ICAM-1)在原發腫瘤和區域轉移淋巴結中的表達，并對三者間的關系進行了分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析選擇2006年10月至2009年10月在我科手術并有術后病理證實淋巴結轉移陽性的胃癌石蠟標本36例，其中男25例，女11例;年齡38～75歲，平均年齡(60±10)歲。所有病例術前均未接受任何治療。每例患者的胃癌組織、相應轉移淋巴結標本均經HE染色病理確診。兔抗人Ezrin、NF-κBp65、ICAM-1多克隆抗體均購自美國 Santa Cruz公司，免疫組化試劑盒購自福建邁新生物技術公司，

1.2 免疫組化染色測定 Ezrin、NF-κBp65、ICAM-1蛋白表達

石蠟包埋標本4 μm連續切片后進行HE和免疫組化染色。切片脫蠟水化，3%過氧化氫孵育、蒸餾水沖洗，以磷酸鹽緩沖液(PBS)浸泡后進行抗原修復。以下嚴格按試劑盒說明操作:工作液封閉、加入一抗、孵育并沖洗后依次加二抗工作液、辣根酶標記鏈酶卵白素工作液。二氨基胺苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染，脫水，中性樹脂封片。

1.3 結果判斷 染色結果由兩位病理學醫師進行雙盲閱片判斷結果。每張切片隨機取5個高倍視野(×400)，每視野均計數100個細胞，計算細胞的陽性率。Ezrin、ICAM-1主要表達在細胞膜和細胞漿內，以出現黃色或棕黃色顆粒為染色陽性;NF-κBp65以細胞核出現黃色或棕黃色顆粒為染色陽性。Ezrin、NF-κBp65、ICAM-1的記分標準:細胞內無陽性表達為(－)，＜50%細胞陽性表達為(+)，≥50%細胞陽性表達為(++)。

1.4 統計學分析 應用SPSS 15.0統計軟件，計數資料采用χ2檢驗，相關性采用Spearman等級相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌組織和區域轉移淋巴結灶中Ezrin、NF-κBp65、ICAM-1表達情況 Ezrin、NF-κBp65在區域轉移淋巴結中表均強于胃癌原發灶(P＜0.05)，在兩種組織間ICAM-1表達強度差異無統計學意義(P＞0.05)。Ezrin、NF-κBp65 在胃癌原發灶、區域轉移淋巴結間表達呈正相關性(P＜0.05)，而ICAM-1在兩種組織中表達無相關性(P＞0.05)。見表1。

表1 Ezrin、NF-κBp65、ICAM-1在胃癌和區域轉移淋巴結組織中的表達 例

2.2 胃癌原發灶及區域轉移淋巴結中Ezrin、NF-κBp65、ICAM-1三種蛋白質的相關關系 胃癌組織中Ezrin與NF-κBp65表達存在正相關關系(r=0.3894，P＜ 0.05)，NF-κBp65 與ICAM-1表達存在正相關關系(r=0.3649，P＜0.05);Ezrin與ICAM-1表達無明顯相關關系(r=0.2867，P＞0.05);在區域轉移淋巴結組織中各因子間無明顯相關關系(r值分別為0.3022，0.2756，0.2928，P＞0.05)。

3 討論

Ezrin蛋白是ERM蛋白家族成員之一，在細胞的生長過程中發揮重要作用，并且具有調節細胞信號轉導、黏附狀態等功能［6］。近年發現，Ezrin蛋白在包括胃癌在內的多種腫瘤中存在過表達，與腫瘤的侵襲轉移密切相關［4，5，7］。胃癌細胞具有很強的侵襲轉移能力，大多數就診的胃癌患者處于進展期，存在轉移灶。隨著胃癌診治技術的進步，目前臨床上對于轉移灶的治療已成為研究熱點，如能有效抑制轉移灶將大大提高胃癌綜合治療效果、改善預后。由于胃癌細胞在轉移過程中許多分子都發生了變化，因此，分析轉移灶與原發腫瘤間的分子差異對了解胃癌轉移規律、尋找治療靶位有重要意義。故本研究對Ezrin等蛋白質在胃癌原發灶、區域轉移淋巴結中的表達進行了檢測。結果發現，與原發腫瘤比較，Ezrin蛋白在胃癌區域轉移淋巴結的表達更強，說明該蛋白在胃癌轉移過程中發生了變化，這種變化導致轉移灶中的腫瘤細胞具有更強的侵襲轉移能力。本結果還顯示，在兩種組織中Ezrin蛋白表達具有相關性，這提示胃癌轉移過程中Ezrin蛋白的變化有一定規律，但具體機制尚待進一步研究。

為進一步了解造成Ezrin蛋白在轉移淋巴結中表達變化的機制，我們進一步檢測了NF-κBp65、ICAM-1的表達情況。NF-кB是一種核轉錄蛋白，在體內多種組織中均有存在，且在多種惡性腫瘤中高表達，該蛋白可通過對相關基因的轉錄調控，推進細胞周期演進并抑制凋亡，在細胞癌變過程中發揮重要作用［8］。Gavert等［9］的研究顯示，NF-кB 通路激活可促進 Ezrin蛋白表達，在結腸癌轉移過程中發揮重要作用。因此，本研究對NF-кB家族中作用明確的NF-κBp65蛋白進行了檢測。結果顯示，NF-κBp65蛋白在胃癌轉移淋巴結中表達強于原發腫瘤，說明該蛋白在轉移過程中發生了變化。結果還顯示，原發腫瘤中Ezrin蛋白和NF-κBp65蛋白存在相關關系，提示二者存在調控關系;但在區域轉移淋巴結中并未發現二者有關，我們推測這是由于胃癌轉移是極其復雜的過程，多種蛋白質和信號轉導通路參與其中，導致轉移淋巴結中Ezrin蛋白和NF-κBp65蛋白關系并不明顯。另外，本研究還檢測了ICAM-1的表達情況。ICAM-1在腫瘤免疫中發揮重要作用，可以促進腫瘤的轉移進展;也有研究顯示［10］，ICAM-1表達與Ezrin蛋白有關。本結果同樣發現在原發腫瘤中二者存在一定關系，但轉移淋巴結中并未發現二者有關。我們同樣認為這是由于胃癌轉移過程的復雜性造成的。

由于胃癌轉移是多種機制、多種轉移相關因子相互間共同作用的結果，Ezrin、NF-κBp65、ICAM-1僅是其中部分因素。因此，評價Ezrin蛋白與腫瘤胃癌轉移關系時必須考慮其他相關因素的影響。總之，本研究證實Ezrin蛋白與胃癌轉移有密切關系，深入探討其作用對胃癌轉移機制研究有重要意義。

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4 Tan J，Zhang C，Qian J.Expression and significance of Six1 and Ezrin in cervical cancer tissue.Tumour Biol，2011，32:1241-1247.

5 Zhao J teins are related to the metastasis and prognosis of gastric carcinomas.Histol Histopathol，2011，26:1111-1120.

6 He ZY，Wen H，Shi CB，et al.Up-regulation of hnRNP A1，Ezrin，tubulin β-2C and Annexin A1 in sentinel lymph nodes of colorectal cancer.World J Gastroenterol，2010，16:4670-4676.

7 Zhao J，Zhang X，Xin Y.Up-regulated expression of Ezrin and c-Met proteins are related to the metastasis and prognosis of gastric carcinomas.Histol Histopathol，2011，26:1111-1120.

8 Niu J，Wang K，Graham S，et al.MCP-1-induced protein attenuates endotoxin-induced myocardial dysfunction by suppressing cardiac NF-кB activation via inhibition of IкB kinase activation.J Mol Cell Cardiol，2011，51:177-186.

9 Gavert N，Ben-Shmuel A，Lemmon V，et al.Nuclear factor-kappaB signaling and ezrin are essential for L1-mediated metastasis of colon cancer cells.J Cell Sci，2010，123:2135-2143.

10 Romero IA，Amos CL，Greenwood J，et al.Ezrin and moesin co-localise with ICAM-1 in brain endothelial cells but are not directly associated.Brain Res Mol Brain Res，2002，105:47-59.