紅豆杉提取物和納米乳包裹紅豆杉提取物作為流感疫苗佐劑的初步研究及其LD50的測定

李 慧 張新文 余 巍 馬艷玲 趙蘭華 王 俊 楊 磊 李映波

流感病毒引起的急性呼吸系統疾病傳播迅速，可反復感染。預防流感大流行暴發的最有效手段是接種流感疫苗［1］。在流感疫苗中使用佐劑能夠增強其免疫原性，減少單劑流感疫苗的用量，對于開發能夠預防潛在的大流行流感的疫苗均具有現實意義［2］。

我國在天然植物藥開發方面具備傳統優勢。曼地亞紅豆杉(Taxusmadia)原產于美國、加拿大，是一種天然雜交品種，是美國FDA批準可以用作提取“紫杉醇”的紅豆杉之一，我國自20世紀90年代引進人工繁殖成功，現在四川、廣西、山東和云南等地已廣泛栽培。

納米乳劑是一種自發形成的、熱力學穩定、外觀透明或近似透明的體系，具有粒徑小且均勻，易于制備，穩定性、流動性均較好，易于注射等優點，可作為藥物載體應用于多種吸收方式的藥物制劑中，是一種較為常見的疫苗佐劑候選［3］。本文在實驗室前期篩選工作的基礎上選取紅豆杉提取物和納米乳包裹紅豆杉提取物進行滅活H3N2流感疫苗的佐劑效果研究并進一步測定了紅豆杉提取物和納米乳包裹紅豆杉提取物的半數致死量(LD50)，為其用藥的安全性研究提供一定參考。

材料與方法

1.實驗動物:健康ICR小鼠，體重18～22g，由本所動物中心提供。實驗前，將小鼠置于常溫動物房中適應飼養1周，標準飼料，飲用水為自來水。

2.主要試劑和儀器:紅豆杉提取物(曼地亞紅豆杉的枝條和樹皮，經鑒定為Taxusmadia。)由本實驗室制備，納米乳由本實驗室制備，H3N2流感病毒滅活疫苗(血凝素含量為43.67μg/ml)由本實驗室制備，氫氧化鋁佐劑(濃度為16.31mg/ml)由中國醫學科學院醫學生物學研究所制備，受體破壞酶(RDE)購自日本SEIKEN公司，聚氧乙烯蓖麻油(EL)購自上?？笊锛夹g有限公司，1，2－丙二醇購自天津市化學試劑三廠，Span 80購自天津市科密歐化學世界開發中心，肉豆蔻酸異丙酯(IPM)購自上?？笊锛夹g有限公司。電子分析天平產自德國Sartorius公司，臺式微型離心機產自美國Beckman公司，電熱恒溫水浴鍋產自上海醫療器械七廠，96孔血凝板產自美國Sigma公司，電熱干燥箱產自上海一恒科學儀器有限公司，磁力攪拌器為德國IKA C－MAG HS系列。

3.實驗方法:(1)紅豆杉提取物的制備:取紅豆杉枝條置烘箱中，60℃干燥，粉碎，為紅豆杉干燥粉末。將制備所得粉末與蒸餾水混合，每10g粉末與150ml蒸餾水混合，浸泡過夜后，加熱回流10h，放置至室溫，過濾后干燥濃縮后即可。(2)納米乳包裹紅豆杉提取物的制備:按EL∶Span80∶丙二醇∶IPM= 1∶1∶2∶2的配方于攪拌瓶中配制納米乳試劑，將計算好劑量的紅豆杉提取物(每只小鼠的紅豆杉提取物注射劑量為0.2mg)溶于納米乳劑，室溫下攪拌至溶液為透明，得到以由納米乳劑包裹的紅豆杉提取物混合溶液(其質量比為紅豆杉提取物∶EL∶Span80∶丙二醇∶IPM∶水=7∶1000∶1000∶2000∶2000∶1000)。(3)佐劑效果檢測:①含佐劑疫苗的配制及對照組設立:本實驗中每只小鼠注射劑量要求:每只小鼠注射0.2m l，含血凝素1.2μg，紅豆杉提取物0.2mg。按所需劑量將紅豆杉提取物溶于疫苗，配制出以紅豆杉提取物為佐劑的流感疫苗。同時參照納米乳包裹紅豆杉提取物制備方法配制出以納米乳劑包裹的紅豆杉為佐劑的流感疫苗。本實驗設立的對照組為:鋁佐劑對照組，其中Al(OH)3含量為0.2毫克/只，血凝素含量為1.2微克/只;疫苗對照組，血凝素含量為1.2微克/只;空白對照組，生理鹽水0.2毫升/只;②免疫小鼠并檢測效價:將標準體重ICR雌性小鼠隨機分為5組，每組7只，分別肌內注射進行初次免疫(表1)。3周后，進行第2次肌內注射免疫。初免后每隔7天采集小鼠尾動脈血，分離血清，檢測血凝抑制(HI)抗體效價［4］。連續監測6周，并分別在1、21和70天時稱取小鼠體重，觀測佐劑對小鼠生長的影響。重復實驗。(4)佐劑的LD50測試:①預實驗:找出0(Dn)和100%(Dm)估計致死劑量。根據體重將小鼠隨機分組，每組5只。禁食24h，不禁水。24h后開始進行預實驗。配制系列濃度的藥液，對小鼠進行一次性腹腔注射，連續觀察7天，每天觀察4次，記錄動物的死亡情況。以小鼠呼吸、心跳停止為LD50的觀察指標。重復預實驗，確定紅豆杉提取物Dm、Dn分別為500和188.5mg/ kg，納米乳包裹紅豆杉提取物Dm、Dn分別為9.5和5.6g/kg;②正式實驗:根據預實驗得到的數據，按1∶0.8分別計算紅豆杉提取物實驗和納米乳包裹紅豆杉提取物實驗中各組給藥劑量(表3、表4)。各組動物禁食24h后按照各組給藥劑量一次性腹腔注射給藥，給藥后飼喂全價日糧，密切觀察7天并記錄實驗結果。

4.統計學方法:采用SASV9.1，SPSS V13.0軟件進行統計分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1.紅豆杉提取物和納米乳包裹紅豆杉提取物對H3N2流感疫苗的佐劑效果:各組HI抗體效價見表1。由表1和圖1觀察到，免疫后，紅豆杉佐劑組的抗體效價一直高于疫苗組3～12倍，納米乳包裹紅豆杉佐劑組的抗體效價一直高于疫苗組4～16倍。14和21天的抗體效價均高于鋁佐劑組，表明二者的免疫增強作用先于鋁佐劑產生。這可能是因為鋁佐劑可以降低某些抗原的反應原性從而推遲了早期抗體的產生;而納米佐劑均勻性好，包裹或吸附的抗原顆粒恰好是巨噬細胞(MΦ)和樹突狀細胞(DC)的首選吞噬目標，在誘導疫苗體液免疫應答的早期優于 Al (OH)3佐劑，能夠快速地激活和提高被免疫小鼠的體液免疫應答和細胞免疫應答水平［5］。在28天時，納米乳包裹紅豆杉提取物佐劑組與鋁佐劑組達到相同的抗體效價水平，而之后的下降幅度較鋁佐劑組緩和，在35天仍高于鋁佐劑組(圖2)。同時，由始至終納米乳包裹紅豆杉佐劑組的效價一直高于單純紅豆杉佐劑組。這可能是因為納米乳可以增強了紅豆杉的免疫活性，促進了Th1型和Th2型免疫應答，誘導了細胞免疫和體液免疫的發生，而鋁佐劑只能夠激發Th2型的體液免疫。同時，納米乳粒徑小，表面積大，包裹紅豆杉后提高了紅豆杉的生物利用度，減少了紅豆杉的使用劑量，并延緩了紅豆杉的釋放，延長了藥物刺激抗體產生的時間使機體產生長效的免疫力。

表1 免疫后各組小鼠平均血清抗體效價

2.佐劑對小鼠體重變化的影響:根據表2計算出各時間段小鼠體重增加的平均值，使用SPSS V 12.0進行方差分析以確認紅豆杉佐劑的疫苗和納米乳包裹紅豆杉佐劑的疫苗對小鼠機體的刺激性。統計結果顯示，差異顯著性水平P=0.992，表明5組小鼠體重增長并無顯著差異。證明以紅豆杉為佐劑的疫苗和以納米乳包裹紅豆杉為佐劑的疫苗對小鼠機體刺激性較小，對其生長并無顯著影響。

表2 各組小鼠不同時間平均體重(g)

3.兩種佐劑的LD50測試結果:實驗數據見表3和表4。以SAS v12.0統計軟件分析得到紅豆杉提取物的LD50為295.43285mg/kg，95%可信區間為257.07704～336.95574mg/kg，并得到以死亡概率單位為應變量，以對數劑量為自變量建立的直線回歸方程為: Y=－15.6625+6.3399X，對該方程的擬合優度Chi－square檢驗結果顯示P=0.795，說明擬合度良好。根據急性毒性分級標準，紅豆杉提取物屬于中等毒級物質［6］。納米乳包裹紅豆杉提取物的 LD50為7.32512g/kg，95%可信范圍為6.90906～7.74439g/kg，并得到以死亡概率單位為應變量，以對數劑量為自變量建立的直線回歸方程為:Y=－16.8027+ 19.4292X，對該方程的擬合優度Chi－square檢驗結果顯示，P=0.393，說明曲線的擬合度良好。根據急性毒性分級標準，納米乳包裹紅豆杉提取物屬于實際無毒級物質［6］。納米乳的減毒作用可能同其特性有關，一方面，納米乳粒徑小，紅豆杉富集于乳滴內后增大了與機體接觸的表面積，增強了佐劑活性，減少了紅豆杉的劑量，并提高了抗原的靶向投遞，降低了紅豆杉的毒性不良反應;另一方面，納米乳的貯存抗原的作用延緩了紅豆杉的釋放，這樣可能使同一時間釋放的毒物不足以對機體有害或者減緩的毒物釋放過程中機體產生了抗毒機制。

表3 紅豆杉提取物LD50實驗結果

表4 納米乳包裹紅豆杉提取物的LD50實驗結果

討論

流感是世界公共衛生的重大挑戰之一，流感傳染性強、流行快、變異迅速，能夠引起多種嚴重的并發癥并導致較高的病死率，已對世界公共衛生安全構成了嚴重威脅。目前防止流感最有效的手段就是接種流感疫苗，但是當流感大規模暴發時，傳統的流感疫苗研發和生產的方法無法滿足在短時間內提供足夠多的疫苗免疫易感人群。因此，研發能夠預防和及時應對大流行流感的疫苗對我國公共衛生具有十分重要的意義［7］。

佐劑是一種抗原輔助劑，與疫苗共同使用可以明顯提高疫苗的免疫效果［8］。若輔以較好的佐劑，即可在增強流感疫苗免疫效果的同時，減少每劑流感疫苗的使用量，讓更多的易感人群能夠接種疫苗，達到迅速應對大流行暴發的目的。

我國在中草藥研究方面具有很大的優勢。充分發揮我國在中草藥方面的優勢，從天然中草藥中篩選出流感病毒疫苗佐劑具有較強的可行性及重要性?，F有的研究成果表明很多中草藥對人體的特異性免疫和非特異性免疫均有不同程度的調節作用，其中多種中草藥提取物具有較好的佐劑效果［9～12］。

納米乳劑作為疫苗佐劑的研究也是近年來的一個熱點。大量的研究證明，納米乳佐劑對于主藥(包括多種天然藥物)成分具有良好的增溶作用，并能促進其吸收，提高生物利用度以及減少過敏反應等。Paul等關于納米乳在乙肝疫苗臨床中應用的報道和Anna等關于納米乳是艾滋病毒疫苗黏膜給藥的有效佐劑的研究，都表明納米乳能有效增強Th1誘導的細胞免疫［13，14］;Hamouda等［15］研究證實納米乳劑可以有效提高血凝素抗原的流感免疫原性。

本研究首次選取了具有抗癌效果的紅豆杉和納米乳包裹的紅豆杉進行動物實驗來檢測二者對流感疫苗的佐劑效果。結果表明，本次實驗中的紅豆杉提取物和納米乳包裹紅豆杉提取物均具有良好的佐劑效果，有效地提高了HI抗體效價，可以減少抗原用量并增強免疫效果，而納米乳包裹的紅豆杉可以增強紅豆杉的佐劑活性，更大程度提高了抗原等的靶向投遞，其產生的免疫增強作用整體優于鋁佐劑。LD50的檢測數據表明二者作為佐劑應用于小鼠，對小鼠的生長狀況沒有明顯的影響，可以作為安全有效的新型疫苗佐劑候選，并為相關的藥物開發和臨床應用提供了毒性依據，同時也明確表明了納米乳可以有效的降低紅豆杉的不良反應。關于紅豆杉的免疫增強機制和對不同疫苗的佐劑效果以及納米乳的免疫增強機制和減毒機制仍需進一步研究，而中草藥和納米乳結合作為聯合佐劑是一個嶄新而有前景的研究方向。

1 WHO/SAGE.Recommended viruses for influenza vaccines for use in the2010～2011 Northern hemisphere influenza season［J］.Wkly Epidemiol Rec，2010，85(10):81－92

2 Brown LE.The role of adjuvant in vaccines for seasonal and pandemic influenza［J］.Vaccine，2010，28(50):803－804

3 Huang MH，Huang CY，Lien SP，et al.Development of multiphase emulsions based on bioresorbable polymers and oily adjuvant［J］.Pharm Res，2009，26(8):1856－1862

4 郭元吉，程曉雯.流行性感冒病毒及其實驗技術［M］.北京:中國三峽出版社，1997:100－104

5 何萍，呂鳳林，陳月，等.納米鋁佐劑吸附HBsAg及其免疫學效應的研究［J］.高等學?；瘜W學報，2006，26(5):886－888

6 周宗燦.毒理學教程［M］.3版，北京:北京大學醫學出版社，2006:145

7 方捍華，袁力勇，李長貴.大流行流感與甲型H1N1流感［J］.中國藥事，2009(12):1216－1220

8 Aguilar JC，Rodríguez EG.Vaccine adjuvants revisited［J］.Vaccine，2007，25(19):3752－3762

9 陳宇，鄭純威，陳國江，等.人參皂苷Rg1免疫佐劑作用的研究［J］.軍事醫學科學院院刊，2009，33(3):251－253

10 Song X，Chen J，Sakwiwatkul K，et al.Enhancement of immune responses to influenza vaccine(H3N2)by ginsenoside Re［J］.Int Immunopharmacol，2010，10(3):351－356

11 羅燕，邵永斌，谷新利，等.黃芪多糖佐劑對雞禽流感－新城疫重組二聯苗免疫效果的影響［J］.中獸醫醫藥雜志，2008，27(5):13－15

12 陶里，段金梅，舒曉明，等.三七皂苷R1對鋁佐劑甲型肝炎疫苗的免疫增強作用［J］.中國生物制品學雜志，2008，21(3):197－200

13 Makidon PE，Bielinska AU，Nigavekar SS，et al.Pre－clinical evaluation of a novel nanoemulsion－based hepatitis B mucosal vaccine［J］.PLoSOne，2008，3(8):e2954

14 Bielinska AU，Janczak KW，Landers JJ，et al.Nasal immunization with a recombinant HIV gp120 and nanoemulsion adjuvant produces Th1 polarized responses and neutralizing antibodies to primary HIV type 1 isolates［J］.AIDSRes Hum Retroviruses，2008，24(2):271－281

15 Hamouda T，Chepurnov A，Mank N，et al.Efficacy，immunogenicity and stability of a novel intranasal nanoemulsion－adjuvanted influenza vaccine in amurinemode［J］.Hum Vaccin，2010，6(7):585－594