Rh IL－21對NK－92M I細胞生物學活性的影響

鄭 瑞 陳葆國 顏衛華 李伯利 章衛國 干靈紅

IL－21主要是由活化的CD4+T細胞和NKT細胞分泌，屬于γc(共同γ鏈)細胞因子家族成員之一［1～3］。至今有不少關于白介素(IL)－21對鼠和人NK細胞生物學調節的研究。曾發現IL－21和IL－15體外共同培養的鼠NK細胞，其增殖受到抑制，IL－21也并非NK細胞早期成熟必須的細胞因子［4］。IL－21可以通過增強鼠NK細胞殺傷活性對NKG2D配體陽性的腫瘤細胞有抑制作用，但也有研究表明IL－21通過下調人primary NK和CD8+T細胞表面NKG2D/DAP10的表達，而抑制primary NK細胞通過NKG2D介導的細胞毒作用［5，6］。可見IL－21對NK細胞功能的調節可能因種群差異存在差異。因此本文通過rhIL－21對NK－92MI細胞生物學活性調節的研究，進一步探討IL－21對NK細胞的免疫調節作用。

材料與方法

1.材料:rhIL－21及Human IFN－γMini ELISA Development Kit購自美國PeproTech公司，細胞毒活性檢測試劑盒CytoTox 96?Non－Radioactive Cytotoxicity Assay購自美國Promega公司，PE標記鼠anti－hNKG2D購自R＆D公司，TRizol Reagent購自美國Invitrogen公司，Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit購自加拿大Fermentas(MBI)公司，凋亡檢測試劑盒購自聯科生物 AnnexinV/PI apoptosis kit，胎牛血清、新生牛血清、馬血清、RPMI－1640及α－MEM基礎培養基均購自美國GIBCO公司。引物由上海基康是生物技術有限公司合成。NK－92MI細胞(惡性非霍奇金淋巴瘤患者外周血NK細胞系NK－92經穩定轉染hIL－2后得到)及K－562細胞(人慢性髓系白血病細胞系)均為本室保存。

2.細胞培養:NK－92MI細胞培養:在α－MEM培養基中加入終濃度為12.5%的胎牛血清和12.5%的馬血清，于37℃、含5%CO2和95%濕度的孵箱常規培養;K－562細胞培養:于RPMI－1640培養基中加入10%的新生牛血清，常規傳代培養。

3.細胞增殖試驗:取處于對數生長狀態良好的NK－92 MI細胞，1200r/min×4min，離心。PBS洗1次，1m lα－MEM完全培養基懸起細胞，計數。調整細胞濃度為1×105/ml，備用。按rhIL－21藥物濃度實驗分4組，分別為0ng/ml，25ng/ ml，50ng/ml和100ng/ml組。配備含200ng/m l rhIL－21的α－MEM完全培養基1ml(取2μl100ng/μl的rhIL－21加入到1mlα－MEM完全培養基)于96孔板實驗各孔加入100μl的α－MEM完全培養基，取含200ng/ml rhIL－21的α－MEM完全培養基加入到第一組各孔，100微升/孔。輕混勻后分別取100微升/孔加入下一個稀釋度的各孔依次倍比2稀釋，3復孔/稀釋度，取NK92 MI細胞懸液100μl加入各相應孔。將96孔板置37℃、5%CO2孵箱中培養，分別在24、48和72h 3個藥物培養時間段收集細胞并計數。

4.細胞毒效應試驗:取生長狀態良好NK－92MI細胞，PBS洗滌兩次后，于100ml培養瓶中按2×105個/ml細胞濃度培養，一組加入終濃度為50ng/ml rhIL－21，一組未加藥物，在37℃、含5%CO2的孵箱常規培養48h。收集預處理后細胞，PBS洗滌3次，把兩組細胞濃度調為4×106個/毫升備用。取U型底96孔板，按CytoTox 96?Non－Radioactive Cytotoxicity Assay試劑盒操作步驟，設靶細胞自然釋放孔、培養基背景孔、靶細胞最大釋放孔、體積校正孔及效應細胞自然釋放孔。取準備好的NK－92MI細胞加入96孔板，以倍比稀釋法設立6個效應細胞濃度梯度，體積50微升/孔。再取準備好的生長狀態良好的靶細胞K－562(2×105個/毫升)50μl加入到相應各孔，使效靶比分別為20∶1、10∶1、5∶1、2.5∶1、1.25∶1共5個濃度梯度，每個梯度4個復孔。在37℃、含5%CO2的孵箱常規培養4h后，以每孔10μl裂解液加入到靶細胞最大釋放孔和體積校正孔，再孵育45min后，取出250g×4min離心，收集上清50微升/孔，移入另一平底96孔板，再加入反應液50微升/孔，避光室溫孵育30min，490nm讀取吸光度值。通過檢測上清中LDH含量計算NK－92MI對K－562細胞的細胞毒活性。細胞毒效應計算公式:細胞毒(%)=(實驗組－效應細胞自發釋放－靶細胞自發釋放)/(靶細胞最大釋放－靶細胞自發釋放)×100%。

5.流式細胞術(FACS)檢測:以50ng/m l rhIL－21預處理NK－92MI細胞48h，同時設PBS對照組(即未加藥組)。收集細胞用PBS洗滌兩次，離心后，用300μl PBS重懸細胞混勻，平分為3管，一管加入anti－IgG－PE/IgG－FITC同型對照熒光標記抗體，一管加入anti－Granzyme B－PE熒光標記抗體，另一管加入anti－hNKG2D－PE熒光抗體，室溫孵育30min，PBS洗滌兩次，細胞用500μl PBS懸起，上機分析。同樣方法培養細胞48h和72h，按AnnexinV/PIapoptosis kit操作步驟檢測rhIL－21對NK－92MI細胞凋亡影響。

6.RT－PCR檢測目的基因的表達:分時收集50ng/ml預處理0、6、12和24h的NK－92MI細胞，PBS洗滌2兩次，細胞計數板計數，每次取同等量細胞，用TRizol試劑盒抽取細胞總mRNA。反轉錄反應取2μl mRNA，總體系為20μl，合成cDNA。PCR反應體系為25μl:2.5μl 10×Buffer，1.5μl 25mmol/L MgCl2，0.5μl dNTP，0.5μl cDNA，各0.5μl上下游引物，0.5μl Taq DNA聚合酶，18.5μl去離子水。反應條件:94℃10min; 94℃1min、56℃45s、72℃45s共38個循環;72℃min;4℃ Hold。取4μl PCR產物用1.3%瓊脂糖凝膠電泳分析，結果用Quantity one軟件進行灰度分析，對目的基因進行半定量。各引物如表1。

表1 各PCR引物序列及擴增片段長度

7.ELISA 檢測IFN－γ的分泌:試驗于96孔板中進行，檢測50ng/m l rhIL－21藥物在不同時間對NK－92MI細胞分泌IFN－γ的影響。體積為200微升/孔，每個時間梯度(12h，24h和48h)3個復孔，同時設培養基(含12.5%胎牛血清和12.5%馬血清的α－MEM)和常規NK－92MI細胞培養對照組，于37℃、含5%CO2的孵箱培養。按 Human IFN－γMini ELISA Development Kit實驗步驟進行，檢測490nm吸光度值。

8.統計學方法:所有數據均采用SPSS 13.0統計軟件分析，計量資料描述用均數±標準差±s)表示，統計分析前各組數據均進行方差齊性檢驗，多組間數據比較采用One－way ANOVA方差分析，組間兩兩比較采用LSD統計方法，兩組間比較采用兩組間獨立樣本t檢驗(細胞殺傷實驗采用配對資料t檢驗)，P＜0.05為差異具有顯著性。

結果

1.RhIL－21對NK－92MI細胞增殖的影響:實驗數據顯示，隨培養時間的延長實驗組及對照組細胞均有不同程度的增殖(One－way ANOVA方差分析，結果顯示各組P均＜0.05)。同時觀察到隨培養時間的延長各組之間細胞的增殖并不同步，實驗組較對照組細胞生長緩慢，特別是在培養72h之后，差異更為顯著(P=0.000)，可見rhIL－21抑制了NK－92MI細胞的正常增殖，但并未看到呈藥物濃度梯度依賴性抑制，統計學顯示各實驗組之間差別無統計學意義(P＜0.05)。結果如表2所示。

表2 不同濃度rh IL－21對NK－92M I增殖的影響

2.rhIL－21對NK－92MI細胞凋亡的影響:鑒于結果1所示，不同劑量rhIL－21對NK－92MI細胞的增殖有不同程度的抑制，我們選擇既能發揮藥效又不至于過度抑制細胞生長的劑量(50ng/ml)進行后續試驗研究。在50ng/ml rhIL－21培養NK－92MI 48h和72h后，Anexin V和PI染色顯示，實驗組和對照組細胞凋亡率的差別無統計學意義(48h，P=0.947; 72h，P=0.325)，且不隨培養時間的延長而增加，即50ng/ml rhIL－21并未增加NK－92MI細胞的凋亡。結果如表3所示。

表3 rh IL－21對NK－92M I凋亡的影響(%)

3.rhIL－21對NK－92MI細胞細胞毒效應的影響:以50ng/ml濃度的rhIL－21預處理NK－92MI 48h后，觀察NK－92MI細胞毒效應的改變。結果顯示在效靶比為5∶1、2.5∶1、1.25∶1時，50ng/ml能增強NK－92MI細胞的細胞毒活性(P＜0.05)。結果如圖1所示。

圖1 rh IL－21對NK－92M I細胞毒效應的影響

4.rhIL－21對NK－92MI細胞相關基因表達的影響:RT－PCR結果顯示，50ng/ml rhIL－21能夠促進NK細胞細胞毒效應相關基因如顆粒酶－B (274bp)、穿孔素(511bp)、IFN－γ(339bp)以及NK細胞表面活化型受體NKG2D基因(416bp)mRNA的表達，且均呈時間依賴性表達增強(P＜0.05)，見圖2，用Quantity one軟件分析目的基因與β－actin的灰度比值見表4。

圖2 RT－PCR鑒定NK－92M I細胞活化相關基因表達

5.rhIL－21對NK－92MI細胞表面NKG2D受體及胞質顆粒酶－B蛋白的調節:50ng/m l rh IL－21處理NK－92MI細胞48h后，細胞表面NKG2D受體的平均熒光強度及胞質顆粒酶－B蛋白的表達均明顯增強(NKG2D，P=0.00;顆粒酶－B，P=0.00)，如圖3及表5所示。

表4 不同時間目的基因的表達量變化

圖3 流式細胞術檢測NK－92M I細胞表面NKG2D受體及胞內顆粒酶－B的表達

表5 NKG2D及顆粒酶－B蛋白平均熒光強度的變化

6.rhIL－21對NK－92MI細胞IFN－γ分泌的影響:根據 ELISA標準曲線公式(y=755.81x2－721.46x+139.66，r2=0.9551)計算相應吸光度值對應的IFN－γ濃度。隨培養時間的延長，兩組細胞分泌IFN－γ水平均有升高(實驗組P=0.000，對照組P=0.000)。但與對照組比較，50ng/ml rhIL－21藥物處理組細胞分泌IFN－γ的能力在24h和48h時，均明顯高于對照組(24h P=0.020，48h P=0.002);而在12h時兩組相比，分泌IFN－γ水平無顯著性差異(P=0.173)，如圖4所示。

圖4 50ng/m l rh IL－21對IFN－γ分泌的影響

討論

自Parrish－Novak等［1］報道IL－21對NK細胞的研究以來，有較多關于IL－21對人及鼠NK細胞增殖、免疫調節及抗腫瘤效應等各方面的研究。針對IL－21對NK細胞增殖的研究，有報道表明IL－21能抑制IL－15或IL－2活化的鼠NK細胞的增殖，并能促使NK細胞通過經典的凋亡途徑發生凋亡［4，7］。雖然種屬不同，但與本研究rhIL－21能不同程度抑制NK－92MI細胞增殖的結果相近。然而這種生長抑制不是NK－92MI細胞凋亡率增加的結果，本研究并未發現rhIL－21培養組和對照組在NK－92MI生長48h后，Annexin V+/PI+雙陽性細胞百分率的差異。這同Skak等［8］報道的，IL－21能促進人外周血純化的NK細胞的存活率結果相吻合，或者至少證明了IL－21不會促進人NK細胞的凋亡。

作為具有天然抗腫瘤活性的NK細胞，其細胞毒效應可受多種細胞因子的調節。研究IL－21對NK細胞細胞毒效應的影響，是IL－21對NK細胞各種免疫調節的綜合體現。本研究結果表明50ng/ml濃度的rhIL－21均能顯著增強NK－92MI細胞對靶細胞K－562的細胞毒效應，這與Skak等［8］的研究結果一致，盡管也有其他研究結果與此不同，但多數研究支持 IL－21能增強 NK細胞細胞毒效應的結論［5～8］。傳統理論認為NK細胞的活化是細胞表面活化型受體和抑制型受體綜合作用的結果，因此本實驗分別從基因和蛋白質水平上檢測了rhIl－21對NK－92MI細胞表面主要活化型受體NKG2D的調節。結果表明，50ng/ml的rhIl－21能逐漸增強NKG2D基因mRNA的表達，并能顯著增強培養48h后NK－92MI細胞表面NKG2D受體的平均熒光強度。Skak等［8］報道IL－21能增強外周血單個核細胞中NK細胞表面細胞毒效應受體NKp46、活化型受體NKG2D及抑制型受體CD94和NKG2A不同程度的表達上調，而最終表現為細胞毒活性的增強。而 Burgess等［6］曾報道IL－21通過下調純化人primary NK細胞表面NKG2D/DAP10的表達，而抑制primary NK細胞通過NKG2D和其配體介導的細胞毒活性。這種結果的差異是否由不同細胞系造成?有待于體內實驗或更多實驗進一步驗證。

RT－PCR結果顯示IFN－γ、穿孔素及顆粒酶的表達隨rhIL－21培養時間的延長而逐漸增強，且IFN－γ的分泌及顆粒酶蛋白表達水平也明顯增強。這進一步驗證了NK－92MI被rhIL－21活化后細胞毒效應的增強機制。IFN－γ是在細胞免疫中發揮關鍵調節作用的細胞因子，顯然rhIL－21促進NK－92MI細胞分泌的IFN－γ，進一步增強了細胞免疫能力。這有利于在腫瘤免疫中機體抗腫瘤免疫的能力，但也可能導致機體過度免疫而產生自身免疫性疾病。當然機體的免疫平衡的維持靠復雜的細胞因子網絡的調節。曾有研究表明高濃度的IFN－γ能下調人NK細胞活化型受體NKG2D基因及蛋白水平的表達，IL－21可以通過對轉錄因子Eomesodermin的抑制而下調CD4+T細胞分泌IFN－γ能力。

通過本實驗的研究，進一步認識了IL－21對人NK細胞免疫調節作用，然而對單純的體外實驗和細胞系研究并不能模擬人體復雜的微環境，實驗結果不能完全揭示疾病狀態下IL－21對NK細胞的調節。因此通過對自身免疫性疾病或腫瘤患者機體免疫狀態的檢測、細胞因子的分析及精細的體內實驗的研究，觀察IL－21在相關疾病中所扮演的角色，將對全面認識IL－21生物學活性非常重要。

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