四磨湯對胃腸道Cajal間質細胞的體外增殖干預作用

王穎航，郭淑婷，牛錦銘，劉宏巖

(1.長春中醫藥大學附屬醫院,吉林 長春,130021；2.長春中醫藥大學,吉林 長春 130117)

四磨湯又名四磨飲，《濟生方》卷二記載由人參、檳榔、沉香、天臺烏藥組成，能破滯降逆，補氣扶正，治七情傷感、上氣喘息、妨悶不食，諸藥合用，可奏順氣降逆，消積止痛之功。文獻報道[1-2]顯示，四磨湯作為促胃腸動力中藥得到廣泛使用，臨床上的應用已涉及到內、外、婦、兒等各科，且取得了較好的療效。四磨湯對于胃腸動力障礙性疾病有明顯調節胃腸運動的作用。有研究[3-4]證實ICC是胃腸道的起搏細胞,可產生自發電節律變化，沿胃腸道傳遞形成慢波。并且還具有傳導慢波，介導腸神經信號傳導等重要功能。胃腸動力障礙性疾病的發生與ICC密切相關，特別是腸道ICC細胞數量的減少或網狀結構的破壞[5-7]。Gibbons等[8]證實在人類正常結腸道組織內,ICC的凋亡是一個持續動態的過程，ICC凋亡的程度反映了ICC細胞網絡的更新能力。因此,延緩ICC的凋亡,維持完整的ICC細胞網絡對于預防和治療胃腸道動力障礙性疾病有重要意義。本實驗初步探討了四磨湯對ICC體外增殖的干預作用,為四磨湯對胃腸動力障礙性疾病的臨床治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 SD大鼠，昆明種小鼠(出生后15 d),雌雄不拘。由吉林大學實驗動物中心提供。

1.1.2 試劑 M199培養基(Gibco),SCF(Sigma)，Ⅱ型膠原酶(Gibco)，胎牛血清，MTT(Sigma)，DMSO(Sigma)，Ficoll400(Sigma)。

1.2 方法

1.2.1 小腸組織單細胞懸液的制備 小鼠禁食12 h后，無菌條件下取距離回盲部10 cm的小腸，放入培養皿，剝離系膜與血管，用PBS(pH 7.0)將小腸內容物沖洗干凈，將小腸用注射器針頭縱行剖開，剝離黏膜層，PBS反復沖洗肌條3～4次，將肌條剪碎至1～2 mm3小塊后放入燒杯中，加入 Ⅱ 型膠原酶(1.3 mg/mL)，37 ℃消化30 min。然后過200目篩網濾去大塊組織，離心，1 500 r/min，3 min。去上清，用10 mL M199重懸細胞，將細胞加入等體積Ficoll400梯度密度液上，3 000 r/min離心10 min，取液面交界細胞沉淀。

1.2.2 細胞培養 用M199培養基(含M199，10%FBS，青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL、5 ng/mLSCF)，調整細胞濃度至1×106/mL,接種至6孔培養板，板中預先放置包被鼠尾膠原(2 ng/cm2)的蓋玻片。放入培養箱內，在37 ℃，5%CO2條件下培養。24 h后換液，移除未貼壁細胞，加培養基繼續培養，每3～4 d換液1次，倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況。

1.2.3 藥物干預

1.2.3.1 直接給藥途徑 四磨湯按照中藥常規煎煮方法，收集藥液，反復離心除雜質取上清，于50 ℃濃縮至1 g/mL藥液，倍比稀釋成低劑量組(1 μg/50 μL)，中劑量組(2 μg/50 μL)，高劑量組(4 μg/50 μL)3組；過濾除菌,于-20 ℃冰箱保存。MTT法測定：調整細胞密度為1×105/mL，每孔200 μL接種于96孔板,用含15%胎牛血清的M199培養基培養細胞，待細胞匯合度達70%左右，加入無血清培養液培養24 h使細胞同步。

實驗共分4組，即空白對照組；四磨湯低、中、高劑量組；每個劑量設6孔，加滅菌后的四磨湯藥液干預，培養48 h，培養結束前4 h各孔加入MTT(5 g/L)20 μL，再繼續孵育4 h后去上清，每孔加入DMSO100 μL，振蕩混勻10 min，于酶標儀測490 nm波長處光密度(OD)值，并計算細胞增殖率。

1.2.3.2 含藥血清給藥途徑 將大鼠隨機分為對照組、四磨湯低劑量組、中劑量組、高劑量組。對照組給予等體積的生理鹽水，四磨湯給藥組以臨床成人日用量的10倍作為中劑量，20倍和5倍分別作為高劑量和低劑量。灌胃給藥連續7 d，第7天重復給藥2次,間隔時間2 h，并于末次給藥1 h后眼球取血，無菌條件下分離血清，置56 ℃水浴30 min滅活，再經0.2 μm濾膜過濾除菌，加入M199培養基，使之終濃度分別為：10%，20%，30%。調整細胞密度為1×105/mL，每孔200 μL接種于96孔板,用含15%胎牛血清的M199培養基培養細胞，待細胞匯合度達70%左右,加入無血清培養液培養24 h使細胞同步。

實驗分空白對照組，四磨湯含藥血清低、中、高劑量組；每個劑量設6孔,加含藥血清干預，培養48 h，培養結束前4 h各孔加入MTT(5 g/L)20 μL，再繼續孵育4 h后去上清，每孔加入DMSO100 μL，振蕩混勻10 min，于酶標儀測490 nm波長處光密度(OD)值，并計算細胞增殖率。

2 結果

2.1 直接給藥途徑四磨湯對ICC的體外增殖干預作用 見表1。

表1 直接給藥途徑四磨湯對ICC的增殖作用(±s)

表1結果顯示：四磨湯中、高劑量組不同程度地促進了Cajal間質細胞的增殖，其中以中劑量組促進作用最為明顯，二者與空白對照組比較有顯著統計學意義(P<0.01)。

2.2 含藥血清給藥途徑四磨湯對ICC的體外增殖干預作用 見表2。

表2 含藥血清給藥途徑四磨湯對ICC的增殖作用(±s)

表2結果顯示：四磨湯含藥血清組干預ICC 48 h后,其細胞增殖率與空白對照組比較有顯著統計學意義(P<0.01)。其中，10%、20%濃度的含藥血清的細胞增殖率顯著升高，而30%濃度的含藥血清細胞增殖率下降，提示不同濃度的四磨湯含藥血清對ICC增殖作用強度不同;10%、20%含藥血清組具有促進細胞增殖作用，30%含藥血清組具有抑制ICC增殖的趨勢。

3 討論

ICC是胃腸道內一種與神經系統密切相關的特殊類型的間質細胞,是具有獨立功能的特殊間質細胞,以網狀結構存在于胃腸道[9]。作為胃腸道神經系統的一種非神經但又與神經密切相關的特殊間質細胞,有潛在的控制胃腸道動力的作用。ICC減少在頑固性慢傳輸性便秘患者結腸動力障礙的發生機制中有非常關鍵的作用[10]。四磨湯在臨床上被廣泛應用于胃腸動力障礙性疾病，具有很好的臨床基礎[11]，現代藥理[12-14]實驗也驗證了其明確的促胃腸動力的作用。但目前仍不清楚究竟四磨湯通過何種途徑防治胃腸功能障礙性疾病。因此，對四磨湯促胃腸動力的分子機制進行深入研究極其必要。本研究通過直接給藥與含藥血清給藥2種途徑,采用MTT法對ICC的增殖進行干預，結果顯示:四磨湯在一定的給藥途徑和藥物濃度情況下具有促進ICC增殖作用，我們分析，四磨湯在臨床上被廣泛應用于胃腸動力障礙性疾病的基礎有可能是通過促進ICC增殖而發揮的作用,其具體的作用機制還有待于進一步研究。

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