活血消癭方對結節性甲狀腺腫模型大鼠甲狀腺細胞增殖和凋亡的影響

涂曉坤，指導：陳如泉

(1.湖北中醫藥大學，湖北 武漢 430061；2.湖北省中醫院，湖北 武漢 430061)

結節性甲狀腺腫是一種常見的甲狀腺病癥，長期甲狀腺腫最終都會發展為結節性甲狀腺腫，如果用超聲或手術病理檢查，幾乎絕大多數臨床診斷的彌漫性甲狀腺腫在超聲檢查中都被發現為結節性甲狀腺腫。其在人群中的發病率為4.0%～7.0%。患者之中女性多于男性，患病率隨年齡增長而增加，大多數為良性病變，惡性率低于5%[1]。目前,結節性甲狀腺腫的門診患者流量急劇增加，關于結節性甲狀腺腫的臨床及實驗研究也日益受到重視。對于結節性甲狀腺腫西醫保守治療主要選用甲狀腺激素抑制性治療，雖然能使某些甲狀腺腫的彌慢性增大部分縮小但對腺體本身作用較小，而且毒副作用大，劑量不易掌握。部分病例主張早期手術切除，但手術治療有復發率高、并發癥多等缺點，病人常難以接受。中醫并沒有結節性甲狀腺腫之病名，根據本病的主要臨床表現一般將其類屬于“癭瘤”的范疇。活血消癭方是陳如泉教授臨床治療甲狀腺腫的經驗方，已有臨床研究[2]顯示活血消癭方治療結節性甲狀腺腫作用優于優甲樂，具有肯定的臨床療效及安全性。

1 實驗材料

1.1 藥品及試劑 丙基硫氧嘧啶(propylthiouracil,PTU)，深圳市中聯制藥有限公司生產；左旋甲狀腺素片(levothyroxine，L-T4)，默克公司生產；PCNA檢測試劑盒，由武漢博士德公司提供；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒，由abcam公司提供。

活血消癭方煎煮液:該方由蜣螂蟲10 g，土鱉蟲10 g，蜈蚣5 g，莪術10 g，王不留行10 g，桃仁10 g，貓爪草10 g，柴胡10 g組成。以上生藥均由湖北中醫藥大學附屬醫院門診部藥房提供。將上藥放在干凈的玻璃杯中加水500 mL浸泡30 min，然后于100 ℃煎煮至500 mL，過濾藥渣后得濾液300 mL，再將藥渣加入400 mL純水繼續煎至300 mL,合并2次煎煮液，分別稀釋至0.264 g/mL、0.132 g/mL、0.066 g/mL。

1.2 儀器 DYY-6C電泳儀，北京市六一儀器廠；Epson Perfection V300 Photo掃描儀，Epson公司；752-P紫外可見光分光光度計，上海現科儀器有限公司。BD-FACS Calibur流式細胞儀，BD公司。

1.3 動物 健康雄性Wistar大鼠30只，體質量150 g左右，由武漢病毒研究所提供。

2 方法

2.1 分組方法 取Wistar大鼠30只，隨機分成6組，每組各5只，即正常組、模型組、L-T4組、小劑量活血消癭方組、中劑量活血消癭方組和大劑量活血消癭方組。

2.2 造模方法 參照Tamura的方法[3]造模。用生理鹽水配成0.1%的PTU溶液,每只大鼠每天按100 mg/kg 體質量連續灌服8周。甲狀腺彩超發現大鼠甲狀腺腫塊,即為造模成功。

2.3 處理方法 正常組灌服生理鹽水，其余5組，即模型組、L-T4組、小劑量活血消癭方組、中劑量活血消癭方組和大劑量活血消癭方組行造模處理。同時L-T4組大鼠每天按100 mg/kg體質量灌服L-T4。小劑量活血消癭方組、中劑量活血消癭方組、大劑量活血消癭方組大鼠每天分別按0.44 g/kg體質量、0.88 g/kg 體質量、1.76 g/kg體質量灌服活血消癭方。

2.4 取材和指標檢測 于8周后處死大鼠，取大鼠雙側甲狀腺，保存于-20 ℃。1)采用Western Blot法檢測PCNA在大鼠甲狀腺組織中的表達，結果以AlphaEase FC軟件取值，計算標本灰度值；2)采用流式細胞儀Annexin V/PI雙染色法檢測大鼠甲狀腺腫組織中的細胞凋亡水平。

3 結果

3.1 各組大鼠甲狀腺組織中PCNA的表達 見表1。

表1 PCNA在大鼠甲狀腺細胞中的表達(±s)

3.2 各組大鼠甲狀腺細胞凋亡水平 見表2。

表2 各組大鼠甲狀腺凋亡細胞比例(±s) %

4 討論

活血消癭方由蜣螂蟲、土鱉蟲、蜈蚣、莪術、王不留行、桃仁、貓爪草、柴胡等組成。蜣螂蟲為方中之君藥，主活血化瘀。土鱉蟲具有散血瘀、消堅結、解凝活血、接骨續筋、消腫止痛、下乳通經等功效。蜈蚣具有熄風止痙，解毒散結，通絡止痛的作用。土鱉蟲、蜈蚣2味，共達活血消癭之效，為方中臣藥。因搜剔經絡之風、濕、痰、瘀，莫如蟲類，絡道疏通，氣血暢流，頑痹方能緩解，處方中用蟲藥以達逐風、活血、化瘀、祛痰之目的。莪術功效行氣破血、消積止痛。王不留行功效活血通經、下乳消腫、利水通淋。桃仁功效活血祛瘀、潤腸通便。貓爪草具有清熱解毒、軟堅化痰、散結消腫等多方面的功效。莪術、桃仁、王不留行、貓爪草配伍，共化癭病之痰血瘀阻，為方中佐藥。柴胡功效解表退熱、截瘧、疏肝解郁、升舉陽氣，為方中使藥。全方藥物配伍共奏活血化痰、消癭化結之效。

結節性甲狀腺腫的發病機制尚不清楚，目前認為[4]可能與甲狀腺細胞的增殖和凋亡失去平衡有關。目前己發現有多種評價細胞增殖的方法，其中PCNA是最常用的指標之一。PCNA是一種分子量為36 KD的蛋白質,在細胞核內合成，并存在于細胞核內，為脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)聚合酶6的輔助蛋白，由于其在DNA復制和修復中的重要功能，已廣泛作為反映細胞增殖的重要指標[5]。在細胞核內存在可溶性與不溶性2種PCNA,可溶性PCNA在細胞周期各期中均有表達,其量在DNA合成過程中不發生明顯變化,易被去污劑提取、甲醇破壞；不溶性PCNA較穩定，不易被去污劑洗脫、甲醇破壞，這種PCNA在G0-G1期細胞中無明顯表達,G1晚期，其表達大幅度增加,S期達到高峰，G2-M期明顯下降，其量的變化與DNA合成一致，一般作為評價細胞增殖狀態的一個指標[6]。臨床研究[7]已經證明PCNA的表達在甲狀腺腫組織中顯著增強。在實驗性大鼠甲狀腺腫模型中，PCNA較正常對照組相比，表達明顯增強，在撤掉致甲狀腺腫因素后，隨著甲狀腺重量的減輕，PCNA的表達也逐漸減弱[8]，此結果與本實驗相符。

細胞發生凋亡時，其細胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常細胞與壞死細胞之間。利用這一特點，被檢測細胞懸液用熒光素染色，利用流式細胞儀測量細胞懸液中細胞熒光強度來區分正常細胞、壞死細胞和凋亡細胞。細胞發生凋亡時，膜上的磷脂酰絲氨酸外露早于DNA斷裂發生，因此Annexin V聯合PI染色法檢測早期細胞凋亡較TUNEL法更為靈敏。另外，Annexin V聯合PI染色不需固定細胞，可避免PI染色因固定造成的細胞碎片過多及TUNEL法因固定出現的DNA片段丟失。因此，Annexin V聯合PI法更加省時，結果更為可靠，是目前最為理想的檢測細胞凋亡的方法。結果與細胞凋亡的關系尚未明了。趙明等[9]的研究發現與正常甲狀腺濾泡細胞相比，非毒性結節性甲狀腺腫甲狀腺濾泡細胞含有較多的凋亡小體，兩者有顯著性差異，提示非毒性結節性甲狀腺腫的發病機理和甲狀腺濾泡細胞的凋亡有密切的關系，也與本實驗的結果相符。

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[8]VELICK J,TITLBACH M,LOJDA Z,et al.Expression of the proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in the rat thyroid gland after exposure to bromide[J].Acta Histochemica,1997,99(4):391.

[9]趙明,杜宏,王堅,等.非毒性結節性甲狀腺腫與細胞凋亡關系的探討[J].天津醫藥,2001,29(9):553-554.