復(fù)方康腎片毒理學(xué)研究

范曉清，袁新政，張永和，王德友

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長春 130117;2.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 長春 130021)

為充分保證復(fù)方康腎片的臨床用藥安全，進(jìn)一步確定該藥物的安全劑量，初步擬定復(fù)方康腎片的人用劑量。我們組織進(jìn)行了包括急性毒性試驗(yàn)和長期毒性試驗(yàn)2部分內(nèi)容在內(nèi)的復(fù)方康腎片的毒理學(xué)研究試驗(yàn)，現(xiàn)將試驗(yàn)的全過程及結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物 急性毒性試驗(yàn)：昆明小鼠36只，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，由長春高新醫(yī)學(xué)動物試驗(yàn)研究中心提供。長期毒性試驗(yàn):Wistar大鼠160只，雌雄各半，6～8周齡，由長春高新醫(yī)學(xué)試驗(yàn)動物中心提供。飼養(yǎng)條件：大鼠分籠飼養(yǎng)(干籠、水沖式)，每籠5只。顆粒全價(jià)飼料，投料量每只大鼠每天按30 g投料,根據(jù)大鼠體質(zhì)量增長情況調(diào)整。自由飲水，常規(guī)飼養(yǎng)，自然光照，溫度20～23 ℃(中央空調(diào))，濕度50%～70%。通風(fēng)每天2次，每次1 h[1]。適應(yīng)環(huán)境1周，活動、糞便等均未見異常后進(jìn)行試驗(yàn)。給藥前用電子秤稱量并記錄各大鼠的體質(zhì)量，然后用苦味酸按頭、背、尾等部位做好標(biāo)記[2]。

1.2 試驗(yàn)藥物 復(fù)方腎康片：由長春中醫(yī)藥大學(xué)新藥研發(fā)中心提供(批號：110703)，規(guī)格：0.8 g/片(每克含生藥量4.15 g)。急性毒性試驗(yàn)時，將該制劑配制成:55%、44%、35%、28%供試驗(yàn)時灌胃給藥。長期毒性試驗(yàn)時，將該制劑分別配制成：40%、30%、20%的混懸液，供試驗(yàn)時灌胃給藥[3]。

1.3 試驗(yàn)儀器 全自動生化分析儀(日本日立公司7070型)，全自動血球分析儀(日本K-3500型)，微量電子天秤(中國上海120-1)。

1.4 急性毒性試驗(yàn)方法 取小鼠16只，隨機(jī)分為4組，每組4只。禁食16 h后，灌胃給予上述濃度的復(fù)方腎康片40 mL/kg體質(zhì)量。結(jié)果各受試組動物給藥后經(jīng)連續(xù)觀察7 d均未見毒性反應(yīng)及死亡，無法找出最大致死劑量。故無法進(jìn)行藥物半數(shù)致死量測定，改為最大耐受量(MTD)測定，方法：1)動物數(shù)量：取小鼠20只，雌雄各半。稱重后分籠飼養(yǎng)，試驗(yàn)前禁食16 h(不禁水)。2)給藥途徑：所有受試動物經(jīng)灌胃給藥(與臨床給藥途徑一致)。3)給藥劑量：按40 mL/kg體質(zhì)量(最大容積)灌胃給予55%的復(fù)方腎康片(最大濃度)。試驗(yàn)當(dāng)日給藥3次，間隔6 h。結(jié)果受試小鼠24 h累積給藥劑量為復(fù)方腎康片66 g/kg體質(zhì)量。連續(xù)7 d對小鼠的毒性反應(yīng)進(jìn)行觀察并記錄[4]。

1.5 長期毒性試驗(yàn)方法 取160只大鼠,隨機(jī)分為對照組、復(fù)方康腎片高劑量、中劑量和低劑量組，每組40只，雌雄各半。4組動物每天上午按下列劑量灌胃給藥1次：復(fù)方康腎片高劑量組6.0 g/kg(40%復(fù)方康腎片混懸液,15 mL/kg體質(zhì)量)；中劑量組4.5 g/kg(30%復(fù)方康腎片混懸液，15 mL/kg體質(zhì)量)、低劑量組3.0g/kg(20%復(fù)方康腎片混懸液，15 mL/kg體質(zhì)量)；對照組給等體積(15 mL/kg體質(zhì)量)自來水灌胃。連續(xù)給藥24周(臨床用藥周期的6倍)。1/2動物停藥后可逆性觀察2周天，共計(jì)26周(182 d)[5-6]。于給藥期結(jié)束(第24周)，對照組和高劑量組各處死20只,中劑量組和低劑量組各處死30只。可逆性觀察期結(jié)束(第26周)，處死每組余下大鼠。對4組大鼠的一般情況、血常規(guī)、血液生化指標(biāo)、尸檢和病理組織學(xué)檢查等情況進(jìn)行對比觀察。

2 結(jié)果

2.1 急性毒性試驗(yàn)結(jié)果 給藥后，小鼠活動減少24 h后逐漸恢復(fù)正常，連續(xù)觀察表明動物飲食量無明顯變化。大、小便及顏色無異常，被毛、膚色無改變，外觀觀察口、眼、鼻等處無異常分泌物，體質(zhì)量監(jiān)測表明體質(zhì)量正常增長，未見與藥毒有關(guān)的中毒反應(yīng),連續(xù)觀察7 d，所有給藥動物無死亡。測得MTD值66 g/kg，相當(dāng)于臨床擬用劑量的647倍。

2.2 長期毒性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 一般情況 試驗(yàn)期間,4組動物均活動自如、毛色光澤、外觀清潔(口、眼、鼻處無不良分泌物)，進(jìn)食量監(jiān)測表明,各組大鼠之間飼料消耗量未見顯著性差異，不同給藥期動物體質(zhì)量監(jiān)測表明，各組動物給藥期體質(zhì)量增長基本一致，組間統(tǒng)計(jì)學(xué)處理未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示動物長期給藥對動物的生長發(fā)育無明顯的影響。

2.2.2 血常規(guī)檢測結(jié)果 見表1。

2.2.3 血液生化指標(biāo)檢測結(jié)果 見表1。

表1 給藥26周時各組大鼠血常規(guī)檢測結(jié)果

2.2.4 尸檢和病理學(xué)檢測結(jié)果 4組動物的心、肝、脾、肺、腎、胃、腸等臟器標(biāo)本的外觀、形態(tài)、大小及顏色均正常，未發(fā)現(xiàn)充血、腫脹及壞死等異常現(xiàn)象；病理學(xué)檢查未見組織萎縮、增生、炎細(xì)胞浸潤及細(xì)胞退行性變等明顯的病理變化及與藥物中毒有關(guān)的病理性改變。給藥組動物的臟器系數(shù)與對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),提示復(fù)方康腎片長期給藥對動物主要器官的生長發(fā)育無明顯的影響。

3 討論

3.1 急性毒性 由于該藥毒性較低，小鼠口服給藥急性毒性試驗(yàn)未能測出LD50，改為動物口服給藥最大耐受量測定(MTD)。按小鼠最大灌胃容量(40 mL/kg)給予最大濃度55%復(fù)方腎康片混懸液，每日3次，結(jié)果受試動物每日內(nèi)累積給藥劑量為66 g/kg體質(zhì)量(折合生藥量為273.9 g/kg)。連續(xù)觀察7 d，所有受試小鼠均未見有異常表現(xiàn)，無一死亡。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)Wright化法則，可以推測出復(fù)方腎康片口服給藥的LD50必大于66 g/kg。由此可以證明該藥毒性較低，口服的安全性很大。

3.2 長期毒性 本試驗(yàn)設(shè)高、中、低3個劑量給藥組,各組動物給藥劑量分別相當(dāng)于臨床擬用劑量(0.102 g/kg)的58.8倍、44.11倍和29.4倍,連續(xù)灌胃給藥24周,可逆性觀察2周。結(jié)果表明復(fù)方康腎片毒性較低，臨床劑量口服安全性較大。復(fù)方康腎片臨床成人口服劑量成藥為7.2 g/d，即70 kg體質(zhì)量成人0.102 g/(kg·d)，療程為30 d。

[1]衛(wèi)生部.新藥審批辦法(有關(guān)中藥部分的修訂和補(bǔ)充規(guī)定)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1992:205-208.

[2]徐叔云.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].2版.北京:人民衛(wèi)生出版社,1991:206.

[3]陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1993:110-120.

[4]王治喬.新藥臨床前安全評價(jià)與實(shí)踐[M].北京:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社,2002:42-43.

[5]張東玲,張秀英.中藥毒理學(xué)的研究進(jìn)展[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志,2005,1(14):51-53.

[6]張雪玲,李建緒.中藥毒性及不良反應(yīng)原因分析與對策[J].中國藥業(yè),2005,14(10):65.