金水六君煎對亞急性衰老模型小鼠氧化應激的影響

彭 圓,田代志,程 靜,張麗君,王 平*

(1.湖北中醫藥大學基礎醫學院，湖北 武漢 430065；2.湖北中醫藥大學中藥資源與中藥復方省部共建教育部重點實驗室，湖北 武漢 430065)

真皮組織學改變是皮膚衰老最顯著特征之一。皮膚衰老與氧化應激的關系已為許多研究所證實。氧化/抗氧化失衡是皮膚衰老的重要發生機制。氧化應激可直接損傷皮膚組織細胞,啟動真皮纖維降解或變性,加劇皮膚老化進程[1]。本課題組在中醫皮膚衰老理論指導下，采取D-半乳糖皮下注射建立亞急性衰老模型,觀察補腎化痰方金水六君煎對衰老模型小鼠氧化應激的影響，探討其作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 昆明種2月齡清潔級小鼠30只，體質量(20±2)g，雌雄各半,由華中科技大學同濟醫學院實驗動物研究中心提供。動物質量合格證號：NO00004136，NO00004137。

1.2 主要藥品與試劑 D-半乳糖(張家港市華昌藥業有限公司)，臨用前溶于超純水,現配為10%濃度；金水六君煎各組分中藥(熟地黃30 g，當歸12 g，半夏12 g，陳皮10 g，茯苓12 g，炙甘草6 g等)購自湖北中醫藥大學國醫堂藥房。按原著換算，依照人單位體質量生藥量求得小鼠單位體質量生藥量，并擴大2倍，常法濃縮成0.70 g/mL(0.70 g生藥/mL)的浸膏，避光冷藏備用。

羥脯氨酸試劑盒(Hyp)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。

1.3 主要儀器 AL104型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；721型分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)；FSH-Ⅱ型可調高速電動勻漿機(江蘇省金壇市恒豐儀器廠)；TGL-16G-A型低溫離心機(AnKe)；光學顯微鏡(重慶光學儀器廠)。

2 實驗方法

2.1 亞急性衰老模型的制作及給藥 根據性別和體質量隨機分組，每組10只，雌雄分籠，共分3組，即空白組、模型組、金水六君煎組(以下簡稱金組)。適應飼養5 d后，參照文獻[2]采用每天頸背部皮下注射10%D-半乳糖1 000 mg/kg造模，共6周。空白組每天頸背部皮下注射超純水(0.10 mL/10 g)，模型組、空白組每天按0.20 mL/10 g體積灌胃給予超純水，金組按濃度0.70 g/mL灌胃等體積的藥物，連續6周。

2.2 生化指標測定 小鼠于第42天給藥處理后，行兩肩胛至兩髂骨之間的備皮。次日行眼眶取血，于3 500 r/min離心5 min，取上層血清，參照試劑盒說明(下同)用于SOD活性與HYP含量的測定。

同時在冰上取背部皮膚組織塊和肺組織制成10%勻漿，檢測SOD活性。另取背部余皮0.1 g左右，檢測皮膚組織HYP含量。

2.3 皮膚形態學觀察 10%中性甲醛溶液固定，常規石蠟包埋切片，HE染色，光鏡(10×10)下觀察。

3 實驗結果

3.1 各組小鼠生化指標變化比較 見表1，表2。

表1 各組小鼠血清SOD、皮膚SOD、肺SOD活性比較±s,n=10)

表2 各組小鼠血清、皮膚羥脯氨酸含量比較±s,n=10)

3.2 皮膚形態學觀察 空白組小鼠皮膚結構完整，表皮與真皮界線清晰，表皮規則，真皮層厚，纖維排列致密、數量多；皮下脂肪細胞稀少；毛囊、皮脂腺清晰可見。與空白組比較，模型組小鼠皮膚顯著變薄，真皮纖維排列疏松、數量減少；皮下脂肪細胞填充明顯增多，達5～7層。與模型組比較，金組小鼠皮膚顯著增厚，真皮纖維排列密集、數量增多，皮下脂肪細胞填充明顯減少，0～2層。

4 討論

皮膚衰老的發生機制尚未完全明了,氧化/抗氧化失衡所引起的氧化應激損傷被認為是皮膚衰老主要發病機制之一。氧化應激是指由于氧化劑增多和(或)抗氧化劑減少導致的氧化/抗氧化失衡狀態。正常情況下機體存在抗氧化物系統,使得體內自由基的產生與消除處于動態平衡，不會產生明顯的氧化應激損傷。在抗氧化物系統中SOD具有較強的抗氧化作用,是體內催化超氧陰離子為過氧化氫的關鍵酶，其含量的高低反映了機體清除氧自由基的能力。羥脯氨酸(HYP)是膠原纖維和膠原蛋白中的一種主要而又相對恒定的非必需氨基酸,其含量的測定已成為檢測機體膠原代謝的重要指標，也是衡量皮膚衰老的指標之一。

皮膚衰老屬中醫學“衰老”范疇，以本虛標實為主要特征，本虛在于臟腑功能虛衰，標實在于痰濁。一方面腎虛為主的臟腑功能失調可導致痰濁的產生，即因虛致實；另一方面，痰濁為患又可影響氣血津液的化生和運行，致本虛更甚，即因實而致虛，兩者互為因果，形成惡性循環。以補腎化痰治法遣方用藥，延緩皮膚老化，能做到標本兼治。結合本課題組對化痰方藥改善肺系疾病的研究[3]成果及國內學者[4-5]對金水六君煎的研究,本實驗選用金水六君煎，觀察其對衰老模型小鼠皮膚氧化應激的影響。

本實驗顯示，D-半乳糖連續6周皮下注射能建立亞急性衰老模型，模型鼠不僅出現血清抗氧化功能的下降，而且皮膚組織SOD活性、血清與皮膚組織HYP含量均明顯下降、皮膚顯著變薄，真皮纖維排列疏松、數量減少。提示存在嚴重的氧化應激損傷。這與Tian等[6]的研究一致。金水六君煎組與模型組比較有顯著差異,提示金水六君煎能明顯改善衰老模型小鼠氧化/抗氧化失衡狀態。此外，應用金水六君煎組后能明顯增強模型鼠肺SOD活性，從而說明減輕肺組織的氧化損傷，可能有助于增強模型鼠肺行水布津，實現濡養滋潤皮毛，延緩皮膚的衰老。

綜上所述，通過補腎化痰，補充陰液之本，使水能潤金，肺之氣陰不受其損，改善肺氣的宣發肅降，肅潔貯痰之器，恢復肺臟的行水布津功能，有助于減輕衰老組織的氧化應激損傷，糾正氧化/抗氧化失衡狀態,這可能是金水六君煎改善衰老模型小鼠皮膚老化的機制之一。

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