微波輔助提取-HPLC法測定神秘果種子中齊墩果酸

盧圣樓等

摘要：通過微波輔助提取法與超聲提取法的比較研究與優化，確定提取神秘果（Ｓｙｎｓｅｐａｌｕｍ ｄｕｌｃｉｆｉｃｕｍ Ｄａｎｉｅｌｌ）種子中齊墩果酸的最佳工藝條件，采用ＨＰＬＣ法測定神秘果種子中齊墩果酸的含量。結果表明微波輔助提取法具有操作簡單、提取時間短和提取率高等優點。

關鍵詞：神秘果（Ｓｙｎｓｅｐａｌｕｍ ｄｕｌｃｉｆｉｃｕｍ Ｄａｎｉｅｌｌ）；微波輔助提取法；超聲提取；高效液相色譜；齊墩果酸

中圖分類號：Ｓ６６７；Ｏ６５７．７文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）04－0816-04

神秘果（Ｓｙｎｓｅｐａｌｕｍ ｄｕｌｃｉｆｉｃｕｍ Ｄａｎｉｅｌｌ）為山欖科神秘屬常綠灌木植物，其果實中含有的神秘果素（Ｍｉｒａｃｕｌｉｎ）是一種變味蛋白，果肉在嘴中咀嚼后，再食酸味食物時其味道會轉甜［１］。２０世紀６０年代引入我國，在海南、云南、廣西等熱帶、亞熱帶地區小面積種植。神秘果可用作食品、醫藥及化妝品等領域的增甜劑、助食劑和食用色素等［２－７］。隨著對神秘果研究的不斷深入，其營養保健作用也日益受到關注。

近年來，微波輔助提取法（Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ＭＡＥ）與超聲波提取法（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ＵＥ）因具有提取效率高、操作簡單方便、無污染、節約能源等優點，在天然產物提取方面得到了廣泛應用［８－１２］。本試驗分別采用微波輔助提取法、超聲波提取法從神秘果種子中提取齊墩果酸，根據齊墩果酸的提取率確定最佳提取方法，并采用ＨＰＬＣ法測定齊墩果酸的含量，旨在為今后神秘果的開發利用提供相關方法。

１材料與方法

１．１材料

神秘果采集于海南省尖峰嶺國家森林保護區，經海南師范大學生命科學學院鐘瓊芯高級實驗師鑒定，神秘果種子經電熱恒溫鼓風干燥箱烘干后，粉碎至６０目備用。

羰基鐵粉（Ｃａｒｂｏｎｙｌ ｉｒｏｎ ｐｏｗｄｅｒ，ＣＩＰ）購于陜西興化化學股份有限公司；齊墩果酸標準品購于四川維克奇生物科技有限公司；正己烷、無水乙醇、三氯甲烷和９５％乙醇（Ｖ／Ｖ）等均為分析純，甲醇為色譜純。

１．２儀器

ＷＲ－Ｃ微波樣品處理系統（北京盈安科技有限公司），ＲＥ－５２型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠），超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），高效液相色譜儀（日本島津公司），ＤＨＧ－９２４６Ａ型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司），ＴＣＬ－１６Ｇ型電動離心機（上海安亭科學儀器廠），ＵＶ－２４５０型紫外分光光度計（日本島津公司）。

１．３提取方法

１．３．１超聲提取法精確稱取神秘果種子粉５．０ ｇ于錐形瓶中，加入５０．０ ｍＬ正己烷溶解，并置于超聲波儀中提取４ ｈ，蒸餾回收正己烷，所得浸膏狀物質先后用水和氯仿洗滌，合并洗滌液，棄水層，氯仿層再用水洗滌６次，棄水層，揮發氯仿，殘余物用甲醇溶解，并定容至１０ ｍＬ，待用。

１．３．２微波輔助提取法精確稱取神秘果種子粉２．０ ｇ于燒杯中，用１ ｇ ＣＩＰ與之充分混合后轉入微波提取罐內，并添加１５ ｍＬ正己烷，蓋上壓力蓋、密封、放入微波樣品處理系統中升溫，于１２０ ℃下保持１２ ｍｉｎ后，將提取液全部轉移并用少量正己烷清洗內罐，合并清洗液和提取液，４ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心５ ｍｉｎ后，揮干上層清液，用甲醇溶解殘余物，定容至１０ ｍＬ，待用。

１．4色譜條件

色譜柱為ＯＤＳ Ｈｙｐｅｒ２ＳＩＬ Ｃ１８（４．０ ｍｍ × ２００ ｍｍ × ５ μｍ），流動相（甲醇∶水＝９０∶１０，V/V），檢測波長為２１５ ｎｍ，柱溫為２５ ℃，流速為１．０ ｍＬ／ｍｉｎ。

１．5齊墩果酸標準溶液的配置

精確稱取齊墩果酸標準品３．００ ｍｇ，定容至１０ ｍＬ，并逐級稀釋得標準系列溶液。按照上述色譜條件，進樣２０ μＬ，以峰面積定量。以齊墩果酸標準品濃度（ｍｇ／ｍＬ）為橫坐標，峰面積（ｍＶ*ｓ）為縱坐標繪制工作曲線，得回歸方程ｙ＝１ ７７１．６７ｘ＋１２ ８０９ ６００，相關系數０．９９９ ８，ＳＤ＝１８６．５６０ ４，Ｐ＜０．０００ １。結果表明齊墩果酸在０．０１～０．０５ ｍｇ／ｍＬ范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

２結果與分析

２．１微波輔助提取法與超聲提取法的比較

采用微波輔助提取法與超聲提取法對神秘果種子中齊墩果酸的提取效果進行比較，其ＨＰＬＣ譜圖見圖１、圖２。由峰面積計算不同方法提取的齊墩果酸含量，結果如表１所示。

從圖１、圖２及表１可以看出，微波輔助提取神秘果種子中齊墩果酸的效果較好，故后續研究主要分析了微波輔助提取神秘果種子中齊墩果酸的提取條件。

２．２微波輔助提取法單因素試驗

２．２．１提取溶劑對提取率的影響分別以正己烷、９５％乙醇（Ｖ／Ｖ）及兩者的混合溶液（１∶１，Ｖ／Ｖ）為提取劑進行微波輔助提取實驗，研究不同溶劑對神秘果種子中齊墩果酸提取率的影響。

采用上述色譜條件測得提取不同溶劑獲得的齊墩果酸含量，結果見表２。由表２可知，正己烷的提取率最高，其次是二者的混合溶液，乙醇的提取效率最低。這表明齊墩果酸在非極性溶劑中有較好的溶解性，故本研究選擇正己烷作為提取溶劑。

２．２．２提取時間對提取率的影響精確稱取２ ｇ神秘果種子粉，加入２０ ｍＬ正己烷，按８、１０、１２、１４、１６ ｍｉｎ等５個時間梯度進行微波輔助提取實驗，考察不同提取時間對齊墩果酸提取效率的影響。

結果表明，提取時間短，則提取率低，隨著提取時間的延長，提取率逐漸增加，但到１２ ｍｉｎ后，增加趨于平緩。另一方面，提取時間的延長也會造成雜質的干擾，所以最終確定１２ ｍｉｎ為最佳提取時間。

２．２．３提取溫度對提取率的影響精確稱取２ ｇ神秘果種子粉，加入２０ ｍＬ正己烷，分別采用５個不同提取溫度（１００、１１０、１２０、１３０、１４０ ℃）進行微波輔助提取試驗，結果見圖３。從圖３可知，提取率隨溫度升高而增大，至１２０ ℃達到最大值，其后提取率緩慢降低。這可能是隨著溫度的升高，分子熱運動加快，浸出速度也隨之加快，但過高溫度可能會破壞齊墩果酸結構，也可能是溫度過高引起乙醇的揮發，造成溶劑損失。根據本試驗結果，最終選擇１２０℃為最佳提取溫度。

２．３精密度試驗

按１．３．２方法前處理，連續進樣５次，每次進樣２０ μＬ，記錄峰面積。結果如表３所示。由表可知，其ＲＳＤ＝０．６２６ ３％，表明本方法的精密度較好。

２．４重現性試驗

取同批次樣品５份，按１．３．２方法進行前處理，和色譜分析，結果如表４所示。由表4可知，其ＲＳＤ＝０．６２６ ５％，表明本法重現性較好。

２．５ＨＰＬＣ分析

采用ＨＰＬＣ測定不同溶劑提取神秘果種子中的齊墩果酸，利用外標法進行定量，保留時間進行定性，其色譜圖見圖４～７。

３小結與討論

通過對神秘果種子中齊墩果酸的提取方法、提取溶劑、提取時間、提取溫度等方面的考察，確定了微波輔助提取的最佳條件為：以正己烷為溶劑，液料比１∶１０，在１２０ ℃下，經過１２ ｍｉｎ提取。本試驗結果表明，采用該方法的提取率高，提取時間短，為今后神秘果的工業化開發及深入研究提供了技術參考。