血清醋酸纖維薄膜電泳實驗常見的問題分析

摘要： 本文闡述了血清醋酸纖維薄膜電泳實驗中電泳圖譜常見的問題，并對產生這些問題的原因進行了分析，以期為生物化學實驗教學提供參考。

關鍵詞： 血清醋酸纖維薄膜電泳生物化學實驗

電泳是帶電顆粒在電場的作用下，向著與帶電顆粒電性相反的電極遷移的現象。電泳法可用于分離、鑒定或提純許多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白質、核苷酸、核酸等，因此電泳法已成為開展生物化學和分子生物學研究工作的一種常規的不可缺少的工具。電泳法(血清醋酸纖維薄膜電泳分離及測定)作為一項基本方法，已成為醫學生生物化學實驗教學常規開設的實驗內容，該法操作簡便，快速、價廉，樣品用量少，實驗技術成熟，分辨能力強，沒有吸附現象、效果直觀，便于保存等優點，但影響電泳圖譜的因素較多，學生在實驗中操作不當等，均可導致實驗失敗而得不到理想的電泳圖譜。因此，為了達到預期的實驗效果、提高學生對電泳實驗的動手能力，根據我校學生血清醋酸纖維薄膜電泳（cellulose acetate membrance electrophoresis，CAME）實驗的實際情況，本文對CAME實驗中電泳圖譜常見的問題進行分析，以期為CAME實驗教學提供參考。

1.出現五條以上的區帶

在CAME實驗中，有的同學電泳實驗結果看起來很“完美”，有“許多”區帶——五條以上（實驗結果應是五條區帶，分別是清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白），為什么會有這種現象呢？原來出現的“許多”區帶（五條以上）正是在點樣中出現的，有的同學在點樣過程中實施“二次”點樣［１］。CAME實驗包含準備、點樣、平衡、電泳、染色、漂洗、定量（該步驟沒要求）等步驟，其中點樣成功是獲得清晰電泳圖譜的關鍵。在試驗中，為了便于學生操作，我們應用玻片進行點樣，有的同學沒有擦干玻片兩側的血清；有的同學覺得點樣量太少，又重復進行一次點樣。沒擦干玻片兩側的血清，導致玻片兩側有兩個點樣面，后者進行的“二次”點樣不可能在同一個位置，在進行電泳時，有的區帶“跑”得快，有的“跑”得慢，區帶與區帶之間有的重疊，有的未重疊，因而分離出五條以上的區帶（事實上，在某一區帶并不是同一種蛋白質）；有的同學進行多次（兩次以上）點樣所得到的電泳圖譜成片。其實在實驗前老師已事先提醒學生不要進行“二次”點樣，并詳細介紹了可能產生“二次”點樣的情況，但少數同學可能沒在意或認為點樣量“看起來太少”，于是又重復進行點樣操作。

2.沒出現電泳區帶或不足五條區帶

有的同學電泳實驗結果沒有出現區帶或不足五條區帶主要有下面一些原因。

2.1醋酸纖維薄膜在電泳儀兩極放反了。電泳是帶電粒子在電場中向電性相反的電極泳動的現象，根據實驗原理，點樣的一側應離負極近，而有的同學正好放反，醋酸纖維薄膜放反會導致帶電的粒子在薄膜上泳動的距離過短，蛋白質“跑到”濾紙上或電泳槽的緩沖液中去了，結果也就不會出現區帶或不足五條區帶。

2.2點樣點反了。實驗要求同學們先在醋酸纖維薄膜點樣處劃線，但有的同學劃線不清楚，結果點樣時也不知道具體的位置，事實上點樣沒有在劃線處（在與之對應的離正極近的一側），造成與上述2.1相同的結果，也不會出現區帶。

2.3點樣沒點上去。點樣時要求同學們用力不能太大也不能太小，太大會造成醋酸纖維薄膜折斷，太小有可能樣品根本沒點到薄膜上或在薄膜上的樣品太少，出現的結果不清晰，甚至沒有區帶。

2.4在光滑面點樣。醋酸纖維薄膜有兩面，一面有光澤，一面無光澤，無光澤面才是實驗要求的點樣面，操作時必須認真加以區別（有光澤的一面發生的是鏡面反射，無光澤的一面發生的是漫反射，以此可以區別）。若點樣錯誤地點在有光澤面上，帶電的蛋白質就不可能在薄膜上移動，也就不可能有五條區帶。

2.5電壓太高或太低。電泳槽兩極之間的膜長度為8cm—10cm，則需電壓25V/cm膜長，電流強度為0.4mA/cm—0.5mA/cm膜寬。當電壓過大或電流強度高，尤其在溫度較高的環境中，可引起蛋白質變性或由于熱效應引起醋酸纖維薄膜緩沖液中水分蒸發，使緩沖液濃度增加，造成膜片干涸，不可能出現電泳的結果（在預實驗中我們曾以此為對照，確實不能出現區帶）。電流過低，則樣品泳動速度慢且易擴散，導致實驗結果實驗圖譜不清晰或成片，達不到預期的效果。在實驗中，當電泳的電壓或電流達不到或超過上述值時，則應增加緩沖液濃度或進行稀釋。緩沖液濃度過低，則區帶泳動速度快，由于擴散變寬，區帶中的蛋白質泳動到濾紙橋甚至到緩沖液中，不能形成五條區帶；緩沖液濃度過高，則區帶泳動速度慢，區帶分布過于集中，形成一片，不易分辨出五條區帶。

2.6點樣用力不均勻或樣品涂在玻片時不均勻。點樣用力不均勻的結果是，樣品有的點上去了，有的沒有，這與取樣涂在玻片不均勻相關。在血清中有的樣品的量比較少，沒點樣上去導致不能形成區帶。

2.7點樣處放在電泳濾紙橋上。醋酸纖維薄膜上有樣品的點樣處不能放在濾紙橋上，薄膜放在濾紙橋上有一個平衡的過程，在此過程中，蛋白質的熱運動可能造成樣品在濾紙上擴散，而得不到五條區帶。

2.8電泳的時間過短或過長。電泳時間過長，造成血清蛋白電泳區帶“跑”到濾紙橋上或電泳槽的緩沖溶液介質中；電泳時間過短，造成血清蛋白電泳區帶沒有完全分離。在CAME實驗時，電泳的時間以45—60min為宜，電泳的時間過短或過長，均得不到滿意的結果。

2.9醋酸纖維薄膜的有光澤的一面向下。有光澤的面向下，導致實驗電流不易通過，不能出現五條區帶。

3.區帶不均勻

3.1選擇的醋酸纖維薄膜不合規定。市售醋酸纖維素薄膜均為干膜片，薄膜的浸潤與選膜是否恰當也是電泳成敗的重要步驟之一。將干膜片漂浮于緩沖液表面，其目的是選擇膜片的厚薄及均勻度，若飄浮于液面的薄膜在15—30s內迅速潤濕，整條薄膜色澤深淺一致，則此膜均勻可用于電泳。若膜片吸水不均勻，有白斑點或條紋，提示膜片厚薄不均勻，則應舍棄不用，以免造成電泳后區帶不均勻或扭曲，區帶與區帶之間界線不清，背景脫色困難，結果重現性差。由于醋酸纖維薄膜親水性比紙小，浸泡30min以上是保證膜片上有一定量的緩沖液，并使其恢復到原來多孔的網狀結構。最好是讓漂浮于緩沖液的薄膜吸滿緩沖液后自然下沉，這樣可將膜片上集聚的小氣泡趕著走。點樣時，應將膜片表面多余的緩沖液用濾紙吸去，以免緩沖液太多引起樣品擴散。但也不能吸得太干，太干則樣品不易進入薄膜的網孔內，而造成電泳起始點參差不齊，影響分離效果。吸水量以不干不濕為宜。為防止指紋對實驗結果的影響，取醋酸纖維薄膜時，應用鑷子或戴指套。

3.2鉛筆劃線時用力過大。鉛筆劃線時用力過大，可將膜條弄破或出現凹陷，而影響電泳區帶分離的均一性。

3.3點樣時用力過大、過小。點樣時用力太大，將膜條弄破或出現凹凸不平，而影響電泳區帶分離效果；點樣時用力過小，玻片可能沒有與膜片接觸，導致點樣量太少，則蛋白質量少，區帶模糊不清。

3.4點樣量不均勻。點樣時，玻片片身必須與薄膜保持垂直，若不垂直，則既可能使點樣量過少，又可能使薄膜折斷或受損；在用玻片進行點樣時，玻片上的樣品涂得不均勻，有的地方多，有的地方少，會導致在醋酸纖維薄膜上的樣品的量分布不均一，實驗的結果也就顯示圖譜不均一。

當然，引起血清CAME圖譜不理想的因素有很多，除上面介紹外，還有加樣量、薄膜的致密性、醋酸纖維薄膜對蛋白質的吸附性、緩沖液的離子強度、電場中的電滲作用、實驗溫度的高低、薄膜放置是否與濾紙橋垂直、血清是否新鮮等諸多因素都可以影響實驗結果。因此，在實驗前，我們應對實驗的條件進行考察，做好預實驗；在實驗中，要對學生進行認真的指導；在實驗結束后，要組織學生討論，對實驗結果認真分析，保證學生實驗順利進行。

參考文獻：

［1］喬明艷.細節決定生化試驗的成敗［J］.廣西教育學院學報，2010,（1）：118-119.