血清醋酸纖維薄膜電泳實(shí)驗(yàn)常見的問題分析

摘要： 本文闡述了血清醋酸纖維薄膜電泳實(shí)驗(yàn)中電泳圖譜常見的問題，并對(duì)產(chǎn)生這些問題的原因進(jìn)行了分析，以期為生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)提供參考。

關(guān)鍵詞： 血清醋酸纖維薄膜電泳生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)

電泳是帶電顆粒在電場(chǎng)的作用下，向著與帶電顆粒電性相反的電極遷移的現(xiàn)象。電泳法可用于分離、鑒定或提純?cè)S多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等，因此電泳法已成為開展生物化學(xué)和分子生物學(xué)研究工作的一種常規(guī)的不可缺少的工具。電泳法(血清醋酸纖維薄膜電泳分離及測(cè)定)作為一項(xiàng)基本方法，已成為醫(yī)學(xué)生生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)常規(guī)開設(shè)的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，該法操作簡(jiǎn)便，快速、價(jià)廉，樣品用量少，實(shí)驗(yàn)技術(shù)成熟，分辨能力強(qiáng)，沒有吸附現(xiàn)象、效果直觀，便于保存等優(yōu)點(diǎn)，但影響電泳圖譜的因素較多，學(xué)生在實(shí)驗(yàn)中操作不當(dāng)?shù)龋蓪?dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗而得不到理想的電泳圖譜。因此，為了達(dá)到預(yù)期的實(shí)驗(yàn)效果、提高學(xué)生對(duì)電泳實(shí)驗(yàn)的動(dòng)手能力，根據(jù)我校學(xué)生血清醋酸纖維薄膜電泳（cellulose acetate membrance electrophoresis，CAME）實(shí)驗(yàn)的實(shí)際情況，本文對(duì)CAME實(shí)驗(yàn)中電泳圖譜常見的問題進(jìn)行分析，以期為CAME實(shí)驗(yàn)教學(xué)提供參考。

1.出現(xiàn)五條以上的區(qū)帶

在CAME實(shí)驗(yàn)中，有的同學(xué)電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果看起來很“完美”，有“許多”區(qū)帶——五條以上（實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)是五條區(qū)帶，分別是清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白），為什么會(huì)有這種現(xiàn)象呢？原來出現(xiàn)的“許多”區(qū)帶（五條以上）正是在點(diǎn)樣中出現(xiàn)的，有的同學(xué)在點(diǎn)樣過程中實(shí)施“二次”點(diǎn)樣［１］。CAME實(shí)驗(yàn)包含準(zhǔn)備、點(diǎn)樣、平衡、電泳、染色、漂洗、定量（該步驟沒要求）等步驟，其中點(diǎn)樣成功是獲得清晰電泳圖譜的關(guān)鍵。在試驗(yàn)中，為了便于學(xué)生操作，我們應(yīng)用玻片進(jìn)行點(diǎn)樣，有的同學(xué)沒有擦干玻片兩側(cè)的血清；有的同學(xué)覺得點(diǎn)樣量太少，又重復(fù)進(jìn)行一次點(diǎn)樣。沒擦干玻片兩側(cè)的血清，導(dǎo)致玻片兩側(cè)有兩個(gè)點(diǎn)樣面，后者進(jìn)行的“二次”點(diǎn)樣不可能在同一個(gè)位置，在進(jìn)行電泳時(shí)，有的區(qū)帶“跑”得快，有的“跑”得慢，區(qū)帶與區(qū)帶之間有的重疊，有的未重疊，因而分離出五條以上的區(qū)帶（事實(shí)上，在某一區(qū)帶并不是同一種蛋白質(zhì)）；有的同學(xué)進(jìn)行多次（兩次以上）點(diǎn)樣所得到的電泳圖譜成片。其實(shí)在實(shí)驗(yàn)前老師已事先提醒學(xué)生不要進(jìn)行“二次”點(diǎn)樣，并詳細(xì)介紹了可能產(chǎn)生“二次”點(diǎn)樣的情況，但少數(shù)同學(xué)可能沒在意或認(rèn)為點(diǎn)樣量“看起來太少”，于是又重復(fù)進(jìn)行點(diǎn)樣操作。

2.沒出現(xiàn)電泳區(qū)帶或不足五條區(qū)帶

有的同學(xué)電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有出現(xiàn)區(qū)帶或不足五條區(qū)帶主要有下面一些原因。

2.1醋酸纖維薄膜在電泳儀兩極放反了。電泳是帶電粒子在電場(chǎng)中向電性相反的電極泳動(dòng)的現(xiàn)象，根據(jù)實(shí)驗(yàn)原理，點(diǎn)樣的一側(cè)應(yīng)離負(fù)極近，而有的同學(xué)正好放反，醋酸纖維薄膜放反會(huì)導(dǎo)致帶電的粒子在薄膜上泳動(dòng)的距離過短，蛋白質(zhì)“跑到”濾紙上或電泳槽的緩沖液中去了，結(jié)果也就不會(huì)出現(xiàn)區(qū)帶或不足五條區(qū)帶。

2.2點(diǎn)樣點(diǎn)反了。實(shí)驗(yàn)要求同學(xué)們先在醋酸纖維薄膜點(diǎn)樣處劃線，但有的同學(xué)劃線不清楚，結(jié)果點(diǎn)樣時(shí)也不知道具體的位置，事實(shí)上點(diǎn)樣沒有在劃線處（在與之對(duì)應(yīng)的離正極近的一側(cè)），造成與上述2.1相同的結(jié)果，也不會(huì)出現(xiàn)區(qū)帶。

2.3點(diǎn)樣沒點(diǎn)上去。點(diǎn)樣時(shí)要求同學(xué)們用力不能太大也不能太小，太大會(huì)造成醋酸纖維薄膜折斷，太小有可能樣品根本沒點(diǎn)到薄膜上或在薄膜上的樣品太少，出現(xiàn)的結(jié)果不清晰，甚至沒有區(qū)帶。

2.4在光滑面點(diǎn)樣。醋酸纖維薄膜有兩面，一面有光澤，一面無光澤，無光澤面才是實(shí)驗(yàn)要求的點(diǎn)樣面，操作時(shí)必須認(rèn)真加以區(qū)別（有光澤的一面發(fā)生的是鏡面反射，無光澤的一面發(fā)生的是漫反射，以此可以區(qū)別）。若點(diǎn)樣錯(cuò)誤地點(diǎn)在有光澤面上，帶電的蛋白質(zhì)就不可能在薄膜上移動(dòng)，也就不可能有五條區(qū)帶。

2.5電壓太高或太低。電泳槽兩極之間的膜長度為8cm—10cm，則需電壓25V/cm膜長，電流強(qiáng)度為0.4mA/cm—0.5mA/cm膜寬。當(dāng)電壓過大或電流強(qiáng)度高，尤其在溫度較高的環(huán)境中，可引起蛋白質(zhì)變性或由于熱效應(yīng)引起醋酸纖維薄膜緩沖液中水分蒸發(fā)，使緩沖液濃度增加，造成膜片干涸，不可能出現(xiàn)電泳的結(jié)果（在預(yù)實(shí)驗(yàn)中我們?cè)源藶閷?duì)照，確實(shí)不能出現(xiàn)區(qū)帶）。電流過低，則樣品泳動(dòng)速度慢且易擴(kuò)散，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)圖譜不清晰或成片，達(dá)不到預(yù)期的效果。在實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)電泳的電壓或電流達(dá)不到或超過上述值時(shí)，則應(yīng)增加緩沖液濃度或進(jìn)行稀釋。緩沖液濃度過低，則區(qū)帶泳動(dòng)速度快，由于擴(kuò)散變寬，區(qū)帶中的蛋白質(zhì)泳動(dòng)到濾紙橋甚至到緩沖液中，不能形成五條區(qū)帶；緩沖液濃度過高，則區(qū)帶泳動(dòng)速度慢，區(qū)帶分布過于集中，形成一片，不易分辨出五條區(qū)帶。

2.6點(diǎn)樣用力不均勻或樣品涂在玻片時(shí)不均勻。點(diǎn)樣用力不均勻的結(jié)果是，樣品有的點(diǎn)上去了，有的沒有，這與取樣涂在玻片不均勻相關(guān)。在血清中有的樣品的量比較少，沒點(diǎn)樣上去導(dǎo)致不能形成區(qū)帶。

2.7點(diǎn)樣處放在電泳濾紙橋上。醋酸纖維薄膜上有樣品的點(diǎn)樣處不能放在濾紙橋上，薄膜放在濾紙橋上有一個(gè)平衡的過程，在此過程中，蛋白質(zhì)的熱運(yùn)動(dòng)可能造成樣品在濾紙上擴(kuò)散，而得不到五條區(qū)帶。

2.8電泳的時(shí)間過短或過長。電泳時(shí)間過長，造成血清蛋白電泳區(qū)帶“跑”到濾紙橋上或電泳槽的緩沖溶液介質(zhì)中；電泳時(shí)間過短，造成血清蛋白電泳區(qū)帶沒有完全分離。在CAME實(shí)驗(yàn)時(shí)，電泳的時(shí)間以45—60min為宜，電泳的時(shí)間過短或過長，均得不到滿意的結(jié)果。

2.9醋酸纖維薄膜的有光澤的一面向下。有光澤的面向下，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)電流不易通過，不能出現(xiàn)五條區(qū)帶。

3.區(qū)帶不均勻

3.1選擇的醋酸纖維薄膜不合規(guī)定。市售醋酸纖維素薄膜均為干膜片，薄膜的浸潤與選膜是否恰當(dāng)也是電泳成敗的重要步驟之一。將干膜片漂浮于緩沖液表面，其目的是選擇膜片的厚薄及均勻度，若飄浮于液面的薄膜在15—30s內(nèi)迅速潤濕，整條薄膜色澤深淺一致，則此膜均勻可用于電泳。若膜片吸水不均勻，有白斑點(diǎn)或條紋，提示膜片厚薄不均勻，則應(yīng)舍棄不用，以免造成電泳后區(qū)帶不均勻或扭曲，區(qū)帶與區(qū)帶之間界線不清，背景脫色困難，結(jié)果重現(xiàn)性差。由于醋酸纖維薄膜親水性比紙小，浸泡30min以上是保證膜片上有一定量的緩沖液，并使其恢復(fù)到原來多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。最好是讓漂浮于緩沖液的薄膜吸滿緩沖液后自然下沉，這樣可將膜片上集聚的小氣泡趕著走。點(diǎn)樣時(shí)，應(yīng)將膜片表面多余的緩沖液用濾紙吸去，以免緩沖液太多引起樣品擴(kuò)散。但也不能吸得太干，太干則樣品不易進(jìn)入薄膜的網(wǎng)孔內(nèi)，而造成電泳起始點(diǎn)參差不齊，影響分離效果。吸水量以不干不濕為宜。為防止指紋對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，取醋酸纖維薄膜時(shí)，應(yīng)用鑷子或戴指套。

3.2鉛筆劃線時(shí)用力過大。鉛筆劃線時(shí)用力過大，可將膜條弄破或出現(xiàn)凹陷，而影響電泳區(qū)帶分離的均一性。

3.3點(diǎn)樣時(shí)用力過大、過小。點(diǎn)樣時(shí)用力太大，將膜條弄破或出現(xiàn)凹凸不平，而影響電泳區(qū)帶分離效果；點(diǎn)樣時(shí)用力過小，玻片可能沒有與膜片接觸，導(dǎo)致點(diǎn)樣量太少，則蛋白質(zhì)量少，區(qū)帶模糊不清。

3.4點(diǎn)樣量不均勻。點(diǎn)樣時(shí)，玻片片身必須與薄膜保持垂直，若不垂直，則既可能使點(diǎn)樣量過少，又可能使薄膜折斷或受損；在用玻片進(jìn)行點(diǎn)樣時(shí)，玻片上的樣品涂得不均勻，有的地方多，有的地方少，會(huì)導(dǎo)致在醋酸纖維薄膜上的樣品的量分布不均一，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也就顯示圖譜不均一。

當(dāng)然，引起血清CAME圖譜不理想的因素有很多，除上面介紹外，還有加樣量、薄膜的致密性、醋酸纖維薄膜對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性、緩沖液的離子強(qiáng)度、電場(chǎng)中的電滲作用、實(shí)驗(yàn)溫度的高低、薄膜放置是否與濾紙橋垂直、血清是否新鮮等諸多因素都可以影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，在實(shí)驗(yàn)前，我們應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)的條件進(jìn)行考察，做好預(yù)實(shí)驗(yàn)；在實(shí)驗(yàn)中，要對(duì)學(xué)生進(jìn)行認(rèn)真的指導(dǎo)；在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，要組織學(xué)生討論，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果認(rèn)真分析，保證學(xué)生實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。

參考文獻(xiàn)：

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