流式細胞術檢測CD55、CD59對陣發性睡眠性血紅蛋白尿診斷價值的探討

邢超　陳慧　楊軍軍　王鄭　郭文堅

[摘要] 目的 探討患者外周血細胞膜上CD55和CD59缺陷對陣發性睡眠性血紅蛋白尿（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH）的診斷價值。 方法 采用流式細胞術對CD55-PE及CD59-FITC標記的患者外周血中性粒細胞和紅細胞進行檢測。對2009年1月～2012年3月來我院就診的13例PNH患者、13例再生障礙性貧血（aplastic anemia，AA）、21例骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndromes，MDS）患者、12例缺鐵性貧血（irondeficient anemia，IDA）患者與同期80例健康體檢者進行回顧性分析。 結果 PNH患者中性粒細胞及紅細胞膜表面CD55、CD59較AA、MDS、IDA及健康體檢者均明顯下降，差異有統計學意義（P < 0.05）。 結論 利用流式細胞術檢測貧血患者外周血紅細胞及中性粒細胞膜上CD55和CD59缺陷，是臨床鑒別診斷PNH與AA、IDA、MDS可靠而敏感的指標。

[關鍵詞] 流式細胞術；CD55；CD59；陣發性睡眠性血紅蛋白尿

[中圖分類號] R446.11[文獻標識碼] B[文章編號] 1673-9701（2012）29-0079-02

陣發性睡眠性血紅蛋白尿（PNH）是獲得性細胞膜缺陷引起的一種溶血性貧血，與再障關系密切，可相互轉變。發病時可表現為貧血、血紅蛋白尿、感染及血栓形成[1]。近年來，流式技術日漸成熟，利用流式細胞術檢測患者外周血中紅細胞與粒細胞表面CD55和CD59是目前絕大多數實驗室診斷PNH的首選方法，較傳統檢測方法敏感性高且方便。本文采用流式細胞術（flow cytometre，FCM）對于59例貧血患者的外周血細胞CD55、CD59缺失率進行檢測，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

對2009年1月～2012年3月來本院及一附醫就診的貧血患者共59例進行回顧性分析，其中PNH患者（A組）13例，男9例，女4例，平均年齡（48.3±11.8）歲；MDS患者（B組）21例，男15例，女6例，平均年齡（67.4±12.8）歲；AA患者（C組）13例，男11例，女2例，平均年齡（30.2±22.4）歲；IDA患者（D組）12例，男5例，女7例，平均年齡（44.5±20.2）歲；同期正常體檢或無貧血相關疾病患者（E組）80例，男42例，女38例，平均年齡（45.2±10.5）歲。

1.2 PNH診斷標準

（1）臨床表現符合PNH；（2）實驗室檢查：酸化血清溶血試驗（Ham試驗）、糖水試驗、蛇毒因子溶血試驗、尿潛血或尿含鐵血黃素試驗中凡符合下述任何一種情況，即可診斷。①二項以上陽性；②一項陽性，但須具備以下條件：（a）兩次以上陽性，或一次陽性，但操作正規，有陰性對照，（b）有溶血證據，（c）能排除其他溶血，如G6PD缺乏所致溶血、自身免疫性溶血性貧血等[2]。

1.3 結果判讀

以健康體檢者紅細胞和粒細胞CD55、CD59表達設定陰性閾值，CD55、CD59百分率減少大于10%認定為PNH陽性，減少5%～10%為可疑陽性。

1.4 試驗方法

所有病例均采用流式細胞術進行紅細胞和粒細胞膜上CD55和CD59檢測。流式細胞儀為BD公司FACS CantoⅡ，所有試劑均購自BD公司。

1.4.1 中性粒細胞熒光抗體標記取患者及同期健康對照者肝素抗凝血各100μL，加入1×BD紅細胞溶血素1 mL，15 min后溶血，棄上清，加入3 mL PBS緩沖液混勻后500 g離心5 min，棄上清，加入CD59-FITC、CD55-PE及同型對照各20 μL，避光反應30 min，加入PBS 400μL，待上機檢測。

1.4.2 紅細胞熒光抗體標記取患者及同期健康對照者肝素抗凝血各20 μL，加入2 mL PBS緩沖液混勻，各取20 μL加入BD專用流式管中，分別加入CD59-FITC、CD55-PE及同型對照各20 μL，避光反應30 min，加入PBS 400 μL，待上機檢測。

1.4.3 流式細胞儀校正取標準熒光微球各數滴（BD公司提供），加1 mL PBS稀釋、混勻，上機調整電壓及補償。

1.5 統計學方法

采用SPSS13.0軟件分析，組間計量資料的比較采用方差檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

PNH患者中性粒細胞CD55陽性率較MDS、AA、IDA及正常對照組均明顯減少，P < 0.05，差異均有統計學意義；PNH患者中性粒細胞CD59陽性率較MDS、AA、IDA及正常對照組均明顯減少，差異均有統計學意義（P < 0.05）。

PNH患者紅細胞CD55陽性率較MDS、AA、IDA及正常對照組相比均明顯減少，P < 0.05，差別均有統計學意義；PNH患者血紅細胞CD59陽性率較MDS、AA、IDA及正常對照組相比均明顯減少，差異均有統計學意義（P < 0.05）。

MDS組患者中性粒細胞及紅細胞表面CD55和CD59陽性率分別與AA組、IDA組及Normal組比較，無明顯變化，差異均無統計學意義（P均>0.05）。見表1，圖1～4。

表1PNH、MDS、AA、IDA組與Normal組血細胞CD55、CD59陽性率（%）

注：P1：A與B、C、D和E比較；P2：B與C比較；P3：B與D比較；P4：B與E比較

3 討論

PNH是一種特殊的獲得性造血干細胞克隆性疾病。近年來的研究證實，位于X染色體上的磷脂酰肌醇聚糖-A（PIG-A）基因發生體細胞水平的突變[3]，α1-6-N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶功能受到影響，進而糖基化磷脂酰肌醇（GPI）合成障礙，導致血液細胞膜表面多種錨定蛋白缺失，如衰變加速因子（CD55）和反應性溶血膜抑制物（CD59），這些可以抵抗補體作用的補體調節蛋白的缺失是導致PNH發病的關鍵所在。發生PIG-A基因突變的造血干細胞再分化和分裂過程中具有增殖優勢而形成的具有體細胞突變和GPI錨定蛋白缺失為特征的細胞群，簡稱PNH克隆[4]。PNH患者必然存在PNH克隆，但PNH克隆也存在于其他骨髓增殖異常疾病。再生障礙性貧血（AA）、骨髓增生異常綜合征（MDS）等骨髓增生異常疾病患者體內也可檢測到PNH克隆的存在，因此這也是導致PNH與AA具有某些相似癥狀的原因[5，6]。

本文通過對59例貧血患者外周血細胞CD55、CD59陽性表達率檢測，表明PNH患者CD55、CD59陽性表達率明顯降低，尤其是在中性粒細胞膜上，其CD55陽性率僅約為52.5%，CD59陽性率約為56.4%，但在紅細胞中其陽性率分別為67.3%和71.8%。提示患者中外周血中性粒細胞CD59缺陷細胞比例高于紅細胞。有學者認為粒細胞壽命短，更新快，測定值主要反映自身造血產出細胞的情況，受輸血影響小，其表面CD59的表達較為穩定，因而外周血中性粒細胞CD59的表達更能反映骨髓中PNH克隆的情況。而在AA患者中可見其也有CD55、CD59的缺失，有個別患者陽性率<95%，但不超過90%，提示疾病可能有進行性變化，有PNH克隆細胞的存在，但仍以正常細胞為主。MDS患者的外周血細胞中CD55、CD59有缺失，其中可見有5例患者缺失率<95%，1例<90%，提示患者存在PNH克隆細胞，今后有概率發展為PNH或PNH-MDS綜合征，有待進一步觀察。

綜上，流式細胞術檢測患者外周血細胞CD55、CD59可作為PNH診斷指標，但在AA、IDA、MDS患者細胞上均有不同程度的改變，與曹文俊[7]報道結果一致。因而對于AA、MDS有著一定的監測意義，故建議把流式細胞術檢測紅細胞與粒細胞膜的CD55、CD59的表達作為PNH的早期診斷檢測項目，并作為PNH、AA、MDS患者長期監測指標之一，對于其臨床診斷與預后都有著極其重要的應用價值。

[參考文獻]

[1]王永才. 血液骨髓細胞檢驗學[M]. 大連：大連出版社，1995：2-10.

[2]張志南.血液病診斷及療效標準[M]. 第2版. 北京：科學出版社，1998：88-96.

[3]俞秋興，單衛民，朱永新，等. AA、MDS、PNH患者CD55、CD59檢測的臨床價值[J]. 臨床檢驗雜志，2002：175-176.

[4]譚齊賢. 臨床血液學和血液檢驗[M]. 北京：人民衛生出版社，2003：149-150.

[5]Azenishi Y，Ueda E，Machii T，et al. CD59-deficiant blood cel1s and PIG-A gene abnormalities in Japanese patients with aplastic anaemia[J].Br J Haematol，1999，104：523-529.

[6]Dunn DE，Tanawattanacharoen P，Boccun IP，et al. Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria cells in patients with bone marrow failure syndromes[J].Ann Intern Med，1999，131：401-408.

[7]曹文俊. CD55/CD59缺陷檢測及其在陣發性睡眠性血紅蛋白尿診斷中的意義[J]. 診斷學理論與實踐，2004，3（6）：416-419.

（收稿日期：2012-06-25）