RNAi干擾HMGB1基因對乳腺癌細胞MCF—7增殖的影響

來雷　楊林軍　翟昌林

[摘要] 目的 探討高遷移率族蛋白1（high mobility group box 1，HMGB1）siRNA干擾后對乳腺癌細胞MCF—7增殖的影響。 方法 構建靶向HMGB1 mRNA的質粒載體pRI—GFP—1、pRI—GFP—2以及陰性對照載體pRI—GFP—Neg，分別轉染乳腺癌細胞MCF—7，48 h、72 h后免疫印跡法（Western blot）檢測HMGB1基因蛋白表達，噻唑藍（MTT）比色法檢測體外增殖活性。 結果 轉染后，與空質粒組pRI—GFP—Neg相比，pRI—GFP—1組、pRI—GFP—2組MCF—7細胞HMGB1蛋白表達下降，MTT顯示干擾組細胞增殖速率與質粒對照及空白對照組相比顯著降低。 結論 應用RNAi技術可以顯著干擾HMGB1蛋白的表達，進而有效抑制MCF—7細胞的增殖活性。

[關鍵詞] 高遷移率族蛋白1；RNA干擾；MCF—7細胞

[中圖分類號] R737.9[文獻標識碼] A[文章編號] 1673—9701（2012）24—0023—03

Effects of HMGB1 silence by RNA interference on the cell proliferation in MCF—7 cells

LAI Lei1 YANG Linjun2 ZHAI Changlin1

1.Department of Oncology，the First People''s Hospital of Tongxiang City in Zhejiang Province，Tongxiang 314500，China；2.Department of Oncology，Changhai Hospital of Shanghai，Shanghai 200433，China

[Abstract] Objective To investigate the effect of HMGB1 RNA interference on MCF—7 cell proliferation. Methods The plasmid construct pRI—GFP—1， pRI—GFP—2 targeted HMGB1 mRNA and negative control construct pRI—GFP—Neg， were transfected into MCF—7 cells. After 48 h， 72 h， using real—time quantitative PCR to detect HMGB1 gene mRNA expression， WB to detect HMGB1 protein expression；the cell proliferating activity in vitro was examined by MTT analysis. Results After transfection， compared with the pRI—GFP—Neg group， the inhibition rates of HMGB1 expression in MCF—7 cells in pRI—GFP—1 group， pRI—GFP—2 group were decreased. The cell proliferation rate was significantly lower in pRI—GFP—1 group than in pRI—GFP—Neg group （P < 0.05）. Conclusion Application of RNAi technology can significantly interfere the HMGB1 gene expression， thus inhibit MCF—7 cell proliferation.

[Key words] HMGB1； Small interfering RNA； MCF—7 cell

高遷移率族蛋白1（HMGB1）在多種腫瘤中高表達，其水平遠高于相對應的正常組織，且與腫瘤的發生發展、病灶大小、浸潤及淋巴結轉移相關。其機制可能與HMGB1本身作為一種細胞因子能夠誘導小血管再生以及可以調控其他一些基因的表達相關。有研究表明HMGB1在乳腺癌組織中的表達與腫瘤臨床分期、病理分級、淋巴結轉移及遠處轉移顯著相關，但是缺乏細胞學研究的報道。本研究應用RNA干擾技術構建了HMGB1基因siRNA真核表達載體，觀察其對人乳腺癌MCF—7 HMGB1基因表達及細胞生長等生物學功能的影響，旨在進一步闡明HMGB1在乳腺癌中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株和質粒

HMGB1 pRI—GFP質粒及陰性、陽性對照質粒由Inovogen公司構建，人乳腺癌MCF—7細胞株由浙江大學醫學院婦產科醫院中心試驗室提供。

1.2 主要試劑

鼠抗人HMGB1單克隆抗體（德國R&D公司），鼠抗人β—actin多克隆抗體、HRP標記羊抗鼠IgG（H+L）（Pierce Biotechnology， Rock—ford，IL），轉染試劑Lipofectin 2000（Invitrogen 公司），實時定量PCR 試劑盒（大連寶生物公司）、RMPI 1640培養液、胎牛血清、無血清無抗生素RMPI 1640培養液。引物由上海生工公司合成。

1.3 MCF—7細胞HMGB1

siRNA 轉染MCF—7細胞用含10%小牛血清和抗生素的RMPI 1640培養液，在37℃、5%CO2培養箱中常規培養，細胞呈貼壁生長。實驗設四組，實驗組pRI—GFP—1、pRI—GFP—2 組、pRI—GFP—Neg（陰性對照）組及空白對照（MCF—7未轉染）組。細胞3×105/孔分別接種6 孔板至細胞長滿85%～90%后進行轉染，具體操作按照試劑說明進行。

1.4 Western blot檢測HMGB1蛋白表達

收集各組細胞，定量后取總蛋白40 μg，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，經轉膜、封閉，加HMGB1 單克隆抗體（稀釋度1∶500）辣根過氧化酶標記二抗（Pierce Biotechnology，美國）化學發光試劑增強反應，X光片曝光顯影，經ABB成像分析系統掃描（ABI公司，美國），以目的蛋白灰度值與內參β—actin灰度值的比值反映HMGB1的表達水平。

1.5 MTT檢測細胞增殖

選擇干擾效率較高的pRI—GFP—1組，細胞轉染0 h、48 h、72 h后，以每孔1 000個分別接種各組細胞于96孔細胞培養板，同時設立空白對照組，培養24 h后，每孔加20 μL的MTT溶液，37℃，5%CO2飽和濕度下孵育4 h，吸出孔內培養液，每孔加二甲基亞嵐（DMSO）150 μL，酶標儀檢測每孔吸光度值（A）。

1.6 統計學分析

采用SPSS 15.0統計學軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩兩比較采用t檢驗，P < 0. 05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 WB檢測各組中HMGB1蛋白的表達

轉染48 h、72 h pRI—GFP—1組、pRI—GFP—2組HMGB1蛋白水平較pRI—GFP—Neg組及空白對照組明顯減低（P < 0.05）， 且pRI—GFP—1組干擾效率優于pRI—GFP—2組；pRI—GFP —Neg組與空白對照組各時間點蛋白表達差異比較無統計學意義（P > 0.05）。

2.2 MTT法檢測細胞的增殖

轉染后48 h、72 h、96 h、120 h pRI—GFP—1組較pRI—GFP—Neg及細胞對照組生長明顯受到抑制，差異有統計學意義（P < 0.05），轉染后96 h細胞生長抑制率達到最高。

3 討論

HMGB1是與染色體結合的非組蛋白成分之一。該蛋白基因定位于人染色體13q12 帶，共含有5 個外顯子，相對分子質量為25 000，由215 個氨基酸組成，屬于HMG 蛋白超家族。HMGB1與DNA結合，可穩定核小體形狀，作為基因和組織特異性的轉錄調控因子有調節轉錄活性的作用。近來的研究表明，多種腫瘤和未成熟細胞均可以產生高遷移率族蛋白HMGB1，與癌細胞侵襲和轉移密切相關。

楊曉文等研究表明，HMGB1在乳腺癌組織中的表達與腫瘤臨床分期、病理分級、淋巴結轉移及遠處轉移顯著相關，但在細胞學的研究未見報道。前期實驗已經驗證了HMGB1在乳腺癌細胞系中是高表達的，本實驗構建了含有U6啟動子的HMGB1 siRNA質粒表達載體并轉染入乳腺癌細胞系MCF—7中，RT—PCR及WB驗證針對兩個不同靶位點的兩條siRNA干擾效率均達到60%，但是pRI—GFP—1的干擾效率要高于pRI—GFP—2，因此我們在生物學功能實驗中選擇pRI—GFP—1干擾質粒。研究結果表明，RNA干擾下調HMGB1基因后，MCF—7細胞增殖受到明顯抑制，細胞生長曲線低平，缺乏指數增長特征。

HMGB1的生物學活性主要通過與其相應受體的相互作用而實現，其中RAGE是HMGB1的主要受體，通過與HMGB1高親和力結合，通過激活p38 MAPK，p44/p42 MAPK，SAPK/JNK等信號通路促進細胞生長[6]。有研究顯示HMGB1可以抑制p53抑癌活性，阻止細胞對損傷DNA的修復，過度活化Ras/ERK信號傳導通路等，抑制HMGB1的表達可能通過以上受體依賴型途徑減慢了細胞生長。HMGB1靶向siRNA抑制細胞增殖的具體分子機制還需進一步證實。

[參考文獻]

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（收稿日期：2012—04—01）