三種脫鈣液對骨組織免疫組化染色的影響

張大貴等

[摘要] 目的 探討三種脫鈣液對骨組織免疫組化染色的影響。 方法 選擇12例骨組織，隨機(jī)分為3組。A組用14%硝酸脫鈣液進(jìn)行處理，B、C組分別用EDTA脫鈣液、PLANK脫鈣液進(jìn)行處理，同時(shí)對CD3、CD68、Ki—67 和TTF—1染色。 結(jié)果 室溫條件下，硝酸脫鈣液的脫鈣時(shí)間最短，但對組織損傷最大。PLANK脫鈣液和EDTA脫鈣液脫鈣效果較好，組織結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)清晰，免疫組化染色較好。 結(jié)論 室溫條件下，三種脫鈣液中PLANK脫鈣液和EDTA脫鈣液對骨組織脫鈣及免疫組化染色效果較好。但由于EDTA脫鈣液脫鈣時(shí)間過長，PLANK脫鈣液脫鈣均勻，速度快，更適合用于臨床病理檢查。硝酸脫鈣液脫鈣最快，但是免疫組化染色效果較差。

[關(guān)鍵詞] 脫鈣液；骨組織；免疫組化染色

[中圖分類號] R446.4+1[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B[文章編號] 1673—9701（2012）24—0101—03

骨組織內(nèi)含有大量無機(jī)鈣鹽，結(jié)締組織堅(jiān)硬，難以直接制片[1]。如果強(qiáng)制切片，在藍(lán)色鈣鹽背景下，往往無法看清細(xì)胞結(jié)構(gòu)，所以需要選擇一種能保持骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)和染色后有利于保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰度和對比度的脫鈣液。本文研究14%（體積分?jǐn)?shù)）硝酸脫鈣液、EDTA脫鈣液、PLANK脫鈣液對骨組織免疫組化染色的影響，以期尋找一種效果比較理想的脫鈣液，對病理診斷工作提供幫助。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本選擇

12例骨組織標(biāo)本均來源于我院，切成1 cm×1 cm×0.3 cm的骨塊，在福爾馬林中性液內(nèi)固定24 h，用于脫鈣及免疫組化染色實(shí)驗(yàn)。

1.2 三種脫鈣液

①脫鈣液Ⅰ：14%（體積分?jǐn)?shù)）硝酸脫鈣液，配制方法為14 mL濃硝酸加入86 mL蒸餾水；②脫鈣液Ⅱ：EDTA脫鈣液，配制方法為EDTA10 g，蒸餾水100 mL，加NaOH充分?jǐn)嚢枞芙猓谟?0 mol/L的HCl調(diào)pH為8.0，最后加入4%甲醛15 mL。③脫鈣液Ⅲ：PLANK脫鈣液，配制方法為氯化鋁10 g，甲酸50 mL，10%福爾馬林10 mL，冰乙酸1.5 mL，加蒸餾水至總體積100 mL。

1.3試劑和儀器

硝酸、鹽酸、EDTA等化學(xué)試劑均購自廣州化學(xué)試劑一廠，CD3、CD68、Ki—67和TTF—1等抗體購自福建邁新公司，EnVision二步法試劑盒購自DAKO公司。切片機(jī)、染色機(jī)和切片刀購自英國shandan公司。

1.4 方法

1.4.1 脫鈣處理三組骨組織分別按以下方法進(jìn)行脫鈣處理：將12例骨組織標(biāo)本平均分為A、B、C三組，并確定所選每份骨組織性質(zhì)一樣，分別將A、B、C組標(biāo)本放入相對應(yīng)的脫鈣液中，間隔一定時(shí)間后更換脫鈣液，以標(biāo)本肉眼觀察至半透明狀，手感有彈性，大頭針可順利刺進(jìn)骨組織，無砂粒感為脫鈣完成，結(jié)合X射線確定脫鈣終點(diǎn)。接著進(jìn)行石蠟切片、免疫組化染色。

1.4.2 免疫組化染色步驟骨組織固定、脫鈣后，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋及制成4 μm厚的連續(xù)切片，裱片后進(jìn)行70℃烤片1 h，脫蠟至乙醇溶液，3%（體積分?jǐn)?shù)）甲醇—H2O2封閉內(nèi)源性過氧化酶10 min，高壓鍋枸櫞酸緩沖液法修復(fù)2 min，加入Ⅰ抗，37℃孵育1 h，加入EnVisionⅡ抗，再于37℃孵育30 min，DAB顯色1 min，蘇木精復(fù)染（圖像分析所用的切片未染色），脫水，透片，封片，光鏡觀察。

1.4.3 免疫組化染色結(jié)果判定CD3陽性信號位于細(xì)胞膜、CD68陽性信號位于細(xì)胞漿、Ki—67和TTF—1陽性信號位于細(xì)胞核。于光鏡下觀察三種脫鈣液脫鈣骨組織免疫組化標(biāo)記的結(jié)果，未復(fù)染的切片做圖像定量分析，其方法為：將每種抗體免疫組化染色后的切片放在顯微鏡下，在同一組的每張切片相同的部位觀察10個視野（4種抗體×10=40個視野），被測物質(zhì)的各種信息通過攝像機(jī)將所測目標(biāo)轉(zhuǎn)換成數(shù)字圖像，傳遞到計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，標(biāo)定組織片空白處入射光的光密度值（OD值），在監(jiān)視器上用不同的分割方法和編輯功能，計(jì)算免疫組化染色陽性細(xì)胞平均OD值，其值代表了切片中相應(yīng)抗原性的相對強(qiáng)度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

圖像分析結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用SPSS 13.0作方差分析。

2 結(jié)果

2.1 不同脫鈣液對骨組織脫鈣時(shí)間及效果比較

2.1.1脫鈣時(shí)間14%硝酸脫鈣液脫鈣時(shí)間最短。14%硝酸脫鈣液

2.1.2脫鈣效果14%硝酸脫鈣液脫鈣效果最好。14%硝酸脫鈣液﹥PLANK脫鈣液﹥EDTA脫鈣液（表1）。

2.1.3對組織損傷 EDTA脫鈣液對組織損傷最小。EDTA脫鈣液

2.2 不同脫鈣液脫鈣對骨組織免疫組化染色結(jié)果比較

見表2 。三種脫鈣液免疫組化染色圖像結(jié)果用方差分析進(jìn)行兩兩比較，其結(jié)果為硝酸脫鈣液和PLANK、EDTA脫鈣液比較有顯著性差異，EDTA脫鈣液和PLANK脫鈣液比較無顯著差異。硝酸脫鈣液對組織損傷較大，切片顏色欠鮮艷，細(xì)胞核著色弱，組織結(jié)構(gòu)欠清晰。PLANK和EDTA脫鈣液脫鈣效果較好，顯微鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)完整、清晰，色澤鮮艷，對比度較好。

2.3 脫鈣后免疫組化染色效果

見表2。見圖1～3。

3 討論

脫鈣是指用化學(xué)或物理方法將骨組織中的鈣鹽和膠原纖維分離，除去鈣鹽，獲得完整的膠質(zhì)纖維成分[2]。骨組織含有大量的鈣鹽和無機(jī)鹽，需經(jīng)過脫鈣處理，使組織軟化后才能進(jìn)行切片處理。常用的脫鈣劑主要包括單純酸類、混合酸類、螯合劑等。免疫組織化學(xué)對臨床病理檢查非常重要，因而應(yīng)選擇較好的脫鈣液對所選骨組織標(biāo)本進(jìn)行較好的脫鈣處理，且不破壞細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)，形態(tài)清楚，進(jìn)而確保免疫組化染色的效果較好并合適臨床需要。

14%硝酸脫鈣液是常用于臨床脫鈣液之一，具有脫鈣能力最強(qiáng)、脫鈣時(shí)間最短等優(yōu)點(diǎn)。但是，對骨組織脫鈣程度較難把握，容易造成過度脫鈣現(xiàn)象；同時(shí)脫鈣后易出現(xiàn)組織腫脹及細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整清晰的不良現(xiàn)象。硝酸在脫鈣過程產(chǎn)生CO2，氣泡從組織中溢出將導(dǎo)致結(jié)締組織分離。另一方面，硝酸對組織進(jìn)行脫鈣時(shí)還酸化組織，造成細(xì)胞核著色能力下降而返藍(lán)困難進(jìn)而變成淡紅色，對比度差，由于亞硝酸形成使組織變黃而影響其后的染色[3]，在室溫條件下更明顯。硝酸在溶解骨組織鈣鹽時(shí)也對抗原物質(zhì)具有破壞性，因而抗原免疫活性降低，免疫組化染色效果不佳[4]。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證硝酸脫鈣液脫鈣后較易影響其后的免疫組化染色效果。

EDTA是科研中常用的脫鈣劑，能夠與羥基磷灰石結(jié)晶的外層鈣結(jié)合，同時(shí)促進(jìn)內(nèi)層結(jié)合鈣向外轉(zhuǎn)移，進(jìn)而溶解鈣鹽，是脫鈣和免疫組化染色理想的脫鈣劑[5]。本實(shí)驗(yàn)觀察到EDTA脫鈣液對骨組織脫鈣效果較好，能保持完整的組織結(jié)構(gòu)，且不破壞抗原物質(zhì)，免疫組化染色陽性細(xì)胞數(shù)量多、著色深、背景淡。然而，在室溫條件下，其脫鈣時(shí)間過長，脫鈣后組織稍微變硬，不太適合臨床電鏡快速診斷的要求，且其價(jià)格較貴，綜合而言不利于臨床檢查工作。目前認(rèn)為，應(yīng)用微波技術(shù)可促進(jìn)EDTA的螯合作用，縮短脫鈣時(shí)間[6]。使用微波技術(shù)時(shí)應(yīng)注意固定實(shí)驗(yàn)條件、調(diào)整微波功率和時(shí)間、溫度也不能超過60℃等。

本研究表明，與硝酸、EDTA脫鈣液比較，PLANK脫鈣液具有常溫脫鈣時(shí)間較短、脫鈣效果較好，免疫組化染色著色鮮艷、對比度佳、陽性細(xì)胞數(shù)多等優(yōu)點(diǎn)。PLANK脫鈣液[7]是一種氯化鋁、甲酸、甲醛和冰乙酸組成的混合脫鈣液，其中甲酸和溶液中的鋁離子對組織影響較小，免疫組化染色效果優(yōu)良。甲醛可加強(qiáng)對組織的固定并具有抗酸浸蝕的作用。冰乙酸能較好保持染色體結(jié)構(gòu)，并能減少酸對細(xì)胞核的破壞。其配制成分中，通過增加甲酸的濃度并用冰乙酸輔助，可以加快脫鈣速度。常溫下PLANK脫鈣液快速軟化組織，對組織抗原損傷較少，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰完整，加之其脫鈣時(shí)間較短、配制簡單、經(jīng)濟(jì)等有利條件，較適合用于臨床檢查工作[8]。

CD3、CD68、Ki—67和TTF—1等細(xì)胞因子多在腫瘤組織中表達(dá)，快速準(zhǔn)確的病理診斷有利于患者的臨床診治。因而，選擇合適的脫鈣液成為重要工作環(huán)節(jié)之一。本實(shí)驗(yàn)通過比較14%硝酸脫鈣液、EDTA脫鈣液和PLANK脫鈣液的脫鈣和免疫組化染色效果，綜合評價(jià)認(rèn)為PLANK脫鈣液較適合用于臨床快速病理診斷。

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（收稿日期：2012—08—18）