不同濃度過氧化脲對牙齦上皮細胞生長影響的實驗研究

郭紅延　王曉玲　朱曉英　伊元夫

[摘要]目的：評價不同濃度過氧化脲對體外培養的人牙齦上皮細胞生長的影響，獲得不同濃度過氧化脲引起人牙齦上皮細胞凋亡的時間范圍。方法：體外培養人牙齦上皮細胞并進行鑒定，采用含10%及20%過氧化脲的EpiLife上皮細胞專用無血清培養基進行培養，選取不同時間段計算細胞死亡率。結果：體外培養的人牙齦上皮細胞為多邊形并呈鋪路石狀外觀，角蛋白染色陽性，含10%過氧化脲培養基進行培養90s后細胞大量死亡，含20%過氧化脲培養基進行培養60s后細胞大量死亡。結論：過氧化脲對體外培養的人牙齦上皮細胞具有較強的細胞毒性，臨床常用過氧化脲污染牙齦時間不能超過1min。

[關鍵詞]過氧化脲；牙齦上皮細胞；細胞凋亡

[中圖分類號]R783.1Q813.1 [文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2012）08-1337-03

隨著人們對美的不斷追求，牙齒美容越來越被人們所重視，牙齒漂白是牙齒美容的一部分，它是根據氧化置換的原理，將牙齒內的色素置換出來，以達到牙齒美白的目的。過氧化脲是常用的牙齒漂白劑之一，隨著臨床牙齒漂白應用的增多以及家庭漂白的普及，過氧化脲的安全性越來越受到重視[1-2]。

在牙齒漂白的臨床操作過程中，與牙齒位置最近的牙齦是最容易受到氧化劑損傷的組織[3]，本研究以體外培養的人牙齦上皮細胞為研究對象，研究不同作用時間下過氧化脲對人牙齦上皮細胞的損傷，為臨床過氧化脲的安全應用提供理論依據。

1材料和方法

1.1 材料：DMEM培養基（Sigma 美國）；胎牛血清（FCS Gibco，美國）；EpiLife角化上皮細胞專用培養基（Cascade Biologics，USA）；胰蛋白酶（Sigma 美國）；兔抗人角蛋白多克隆抗體（MAXIM-BIOTECH，美國）；鼠抗兔IgG（MAXIM-BIOTECH，美國）；SABC免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 選取臨床冠延長術患者，簽署知情同意書，切取健康牙齦組織，置入含15%胎牛血清的DMEM培養基中。實驗室中修剪所獲得的牙齦組織，剪除纖維結締組織，用含100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的D-Hank's液反復清洗，浸泡20min，然后剪成約0.5mm3的組織塊，均勻鋪于培養瓶底，5%CO2培養箱中倒置2h，然后加入15%胎牛血清的DMEM培養基進行常規細胞培養，3天后觀察有上皮細胞自組織塊邊緣爬出并生長，繼續培養7天后換用EpiLife上皮細胞專用無血清培養基進行培養，每2天更換培養基，待細胞生長至約瓶底的70%～80%時進行傳代繼續培養。

1.2.2 細胞爬片、鑒定：在培養皿中置入消毒的蓋玻片，將傳代培養的細胞消化后接種于消毒的蓋玻片表面，靜置24h后加入培養液，放入二氧化碳培養箱中培養。在培養后第10天，取出生長有上皮細胞的蓋玻片，PBS液沖洗干燥制備原代培養的細胞爬片。角蛋白抗體染色采用即用型SABC免疫組化染色試劑盒（博士德公司），一抗為1∶500兔抗人角蛋白多克隆抗體，二抗為生物素標記的鼠抗兔IgG，第2層為酶標生物素-卵白素復合物，DAB顯色，中性樹膠封片。PBS作空白對照，同時設立成纖維細胞組為陰性對照組。

2結果

2.1 細胞培養及鑒定結果：組織塊貼壁后，第三天開始有上皮細胞從組織塊邊緣爬出，并以組織塊為中心向四周生長，細胞呈多邊形，緊密排列，呈鋪路石狀外觀。細胞核大而圓或者卵圓形，有多個核仁，胞漿豐滿，細胞分布均勻，大小一致。培養至7～10天時改用EpiLife上皮細胞專用無血清培養基進行培養后，細胞形態沒有明顯改變，但細胞體積有所減小，排列稍松散。待到細胞進行傳代培養后，細胞貼壁后分布均勻，形態以多邊形為主出現多樣化。細胞來源鑒定：細胞免疫組化染色顯示胞漿內呈棕黃絲網狀，表明角蛋白陽性。

3討論

過氧化脲（carbamide peroxide，CP）又稱過碳酰胺、過氧化氫尿素、過氧化碳酰胺，是尿素和過氧化氫所形成的加合物，兼有尿素和過氧化氫的特性，尿素的氨基既能中和過氧化氫的酸性，又克服了過氧化氫難以儲存和運輸的缺點。過氧化脲理論活性氧含量為17.0%，同其它的幾種過氧化物相比，過氧化脲具有活性氧值高，水溶液pH值低，穩定性好，溶解度大，釋氧速度慢，作用時間長，用后無殘余毒性，對皮膚刺激性、破壞性小等優點，因此，臨床上過氧化脲是最常用的漂白劑之一[4]。早在20世紀60年代末，有國外學者就將10%的過氧化脲放置于為患者專門制作的托盤中，這樣患者就可以在家中自行漂白。20世紀90年代初，有學者報道了活髓牙夜間漂白技術，因其安全、有效、方便而深受醫患雙方的青睞[5]。

一般來講1%～10%的CP用于家庭漂白，30%～35%的CP常用于診室漂白。10%CP是常用家庭漂白劑，因其安全性和有效性，現已被美國牙醫協會（American Dental Association， ADA）接受[6]。目前，家庭漂白劑使用的濃度有增高趨勢，15%～35%的CP已出現在家庭漂白劑市場上。有制造商和臨床醫生宣稱濃度高于10%的CP可以獲得更滿意的臨床漂白效果[7]。

然而，過氧化脲作為一種強氧化劑，其細胞刺激性也深為臨床醫生們所擔憂，濃度越高，其針對組織與細胞所產生的刺激性作用就越大，有學者研究了相關過氧化氫及過氧化脲針對成纖維細胞以及牙齦成纖維細胞的毒性作用[8]，但作為臨床漂白劑的使用，其最主要的接觸對象是牙齦上皮組織，也就是說，牙齦上皮細胞對過氧化脲的毒性反應應該是醫生及使用者最為關心的。牙齦上皮細胞的培養不論從取材到原代培養，都比較困難，在取材方面，由于正常牙齦組織需要臨床切除的患者較少，只能從冠延長術以及種植手術過程中獲得，因此臨床取材需要有一定的限制。在細胞培養方法上，牙齦上皮細胞的培養一般有組織塊法及酶消化法兩種方法，傳統的組織塊培養法一般采用含血清的低糖或者高糖DMEM培養基，血清具有營養、促進細胞和組織貼附、促進生長的作用，在組織塊法細胞培養的初期可以增加組織塊的貼壁率以及細胞從組織塊邊緣的爬出。而酶消化法成功培養牙齦上皮細胞較為困難。本研究采用組織塊培養法進行原代人牙齦上皮細胞培養，然后更換EpiLife上皮細胞專用無血清培養基繼續培養，最后獲得分化良好，數量足夠的牙齦上皮細胞。

細胞培養方法是一種非常敏感的細胞毒性試驗法，有學者采用體外培養的細胞系檢測口腔應用藥物的細胞毒性[9]，但該方法有一定的局限性，一般只能提供有關物種細胞對材料反應的信息，由于體外培養和體內環境的差別，這種方法不能提供體內有關組織對材料如何反應的信息。本研究采用臨床常用10%和20%過氧化脲濃度配制EpiLife上皮細胞專用無血清培養基，對體外培養的人牙齦上皮細胞進行處理，結果發現含10%濃度過氧化脲的培養基處理90s后，細胞開始大量死亡，而含20%濃度過氧化脲的培養基處理60s后，細胞開始大量死亡。結果表明，臨床常用濃度的過氧化脲對牙齦上皮細胞具有較強的細胞毒性，隨著接觸時間的延長，其對細胞的破壞作用也越大。體外培養的人牙齦上皮細胞因為其培養環境以及細胞間相互連接都和體內有很大區別，這就使得體外培養的牙齦上皮細胞較為脆弱，本研究所獲得的實驗數據只是針對體外培養的人牙齦上皮細胞，含同樣濃度的過氧化脲美白產品對口內牙齦上皮產生損害的時間應該相應的長一些。

[參考文獻]

[1]Alonso de la， Pena V， Balboa Cabrita O. Comparison of the clinical efficacy and safety of carbamide peroxide and hydrogen peroxide in at-home bleaching gels[J].Quintessence Int，2006，37（7）：551-556.

[2]Demarco FF， Meireles SS， Masotti AS. Over-the-counter whitening agents： a concise review[J].Braz Oral Res，2009，23 Suppl 1：64-70.

[3]Lazarchik DA， Haywood VB.Use of tray-applied 10 percent carbamide peroxide gels for improving oral health in patients with special-care needs[J].J Am Dent Assoc，2010，141（6）：639-646.

[4]Strassler HE， Scherer W， Calamia JR. Carbamide peroxide at-home bleaching agents. An update[J].NY State Dent J，1992，58（4）：30-35.

[5]王曉玲，趙信義，何惠明，等.過氧化脲漂白劑的配置與標定[J].中國美容醫學，2007，16（5）：680-682.

[6]Lazarchik DA， Haywood VB. Use of tray-applied 10 percent carbamide peroxide gels for improving oral health in patients with special-care needs[J].J Am Dent Assoc，2010，141（6）：639-646.

[7]王曉玲，郭紅延，馬妍，等.過氧化脲漂白劑的臨床效果評價[J].中國美容醫學，2009，18（8）：1148-1152.

[8]Soares DG，Ribeiro AP，Sacono NT，et al. Transenamel and transdentinal cytotoxicity of carbamide peroxide bleaching gels on odontoblast-like MDPC-23 cells[J].Int Endod J，2011，44（2）：116-125.

[9]Babich H，Wurzburger BJ，Rubin YL，et al. An in vitro study on the cytotoxicity of chlorhexidine digluconate to human gingival cells[J].Cell Biol Toxicol，1995，11（2）：79-88.

[收稿日期]2012-02-26[修回日期]2012-04-12

編輯/張惠娟