砒霜的抗腫瘤作用研究

摘 要 目的：觀察砒霜及其與青黛組成的復方對小鼠皮下移植Lewis肺癌和4T1乳腺癌的影響。方法：采用小鼠Lewis肺癌皮下移植模型和4T1乳腺癌肺轉移模型，觀察砒霜及其與青黛組成的復方的抗腫瘤作用。結果：砒霜注射劑能夠抑制小鼠Lewis肺癌腫瘤的生長，靜脈注射和局部注射腫瘤抑制率分別為37.29%、48.48%；砒霜、青黛復方能減少4T1乳腺癌小鼠肺轉移結節數，增加特異性免疫碳粒廓清指數，但復方砒霜:青黛=1:49的效果更明顯。結論：砒霜的抗腫瘤作用與用藥途徑和治療方式有關。

關鍵詞 砒霜 Lewis肺癌 4T1乳腺癌

doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2012.06.001

Abstract Objective:To observe the anticipition of arsenic and its compound composed of Qingdai to subcutaneous transplantation of mouse Lewis lung cancer and the impact of 4T1 breast cancer.Methods:The mouse model of Lewis lung carcinoma subcutaneous 4T1 breast cancer lung metastasis model and to observe the composition of arsenic and its compound Qingdai anti-tumor effect.Results:arsenic injection to inhibit Lewis lung tumor growth in mice，intravenous injection and local injection of tumor inhibition rates were 37.29%，48.48%;arsenic，Qingdai compound can reduce the 4T1 mouse breast cancer lung metastasis nodes to increase specific immune carbon clearance index，but arsenic compound:Qingdai=1:49 is more effective.Conclusion:arsenic have some anti-tumor ability of mice，but its effect may be related to dosage and administration pathway.

Key Words Arsenic;Lewis lung cancer;4T1 breast cancer;Subcutaneous tumor model

腫瘤在人類死亡的主要疾病中居前列，近年來發生率呈上升趨勢^［1］。肺癌是當今威脅人類生命健康的第一大腫瘤^［2］；乳腺癌是一種生長速度較緩慢的腫瘤，其早期癥狀并無特殊性，是女性最常見的惡性腫瘤之一。現代醫療對癌癥治療包括外科手術、放射治療、化學治療及中醫藥治療等綜合療法。但傳統的手術及放、化療過程對病變組織和正常組織的選擇性較差，常引起各種并發癥和后遺癥^［3］。中醫藥以其整體觀念、辨證施治理論為指導，采用扶正祛邪、標本兼治的治療方法，成為腫瘤防治的重要手段之一^［4］。

中藥砒霜為白色粉末，無臭，無味，能溶于水、乙醇、酸類及堿類。加熱則升散而發蒜臭，為砒石經升華而得的精制品，其主要成份是三氧化二砷（As2O3）。根據《開寶本草》記載味苦酸，有毒；《玉楸藥解》中記載辛，熱，大毒；《玉楸藥解》則為入脾、肺、肝經。經砒霜提取的有效成份砷劑制成的靜脈制劑為As2O3或亞砷酸。目前該藥已廣泛應用于臨床治療多種惡性血液病，如白血病、骨髓瘤、骨髓增生異常綜合征等，并得到全世界的公認^［5，6］。本文以Lewis肺癌和4T1乳腺癌的移植模型探討砒霜的腫瘤治療作用。

材料與方法

試劑和藥品：砒霜，開封市第二人民醫院提供；青黛，陜西薈科天然產物有限公司提供；印度墨汁，北京篤信精細制劑廠，批號：04082；鹽酸腎上腺素注射液，1ml×1mg×10支，重慶迪康長江制藥有限公司；TBA，DTNB，沃凱國藥化學試劑有限公司提供；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX酶)、過氧化氫酶(PAT酶)、過氧化氫、丙二醛(MDA)均購自南京建成工程研究所；其他試劑為市售分析純。

實驗動物和瘤株：C57BL/6小鼠及BALB/c小鼠，雌性，18～22g，購自河南省實驗動物中心；Lewis肺癌瘤株、4T1乳腺癌瘤株，購于上海細胞所，本實驗室C57小鼠自身傳代保存的實體瘤。

實驗儀器：潔凈工作臺，100級潔凈等級，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；快速混勻器，SK-1，常州國華電器有限公司；不銹鋼手提式滅菌器，DSX-280A，上海市申安醫療器械廠；臺式離心機，TDL-50B，上海安亭科學儀器廠；FA1004N型分析天平，上海精密科學儀器有限公司天平儀器廠；倒置生物顯微鏡，XD-1014，南京江南光電(集團)股份有限公司；ELX800UV型酶標儀，美國，BIO-TEK；游標卡尺。

對小鼠Lewis肺癌皮下移植腫瘤的影響的測定^［7］：將在體小鼠Lewis肺癌實體瘤組織用組織勻漿器制備單細胞懸液，調細胞數2×106/ml。Lewis肺癌單細胞懸液0.2ml/只接種于30只C57BL/6小鼠右腋下皮下，后將小鼠隨機分成三組，每組10只。接種次日開始靜脈給藥，對照組給以生理鹽水(10ml/kg)。砒霜實驗治療組給砒霜注射劑(0.1ml/10g)。靜脈注射組，每2天給藥1次，連續給藥16天；局部注射組，自腫瘤長出之日起每天給藥1次，連續給藥16天。自腫瘤長出用游標卡尺每兩天測量腫瘤體積長徑與短徑各1次。結束治療次日，于小鼠內眥取血，4℃保存3～4小時。后將小鼠脫臼處死，剝離腫瘤、脾臟、胸腺，稱重，按照公式計算抑瘤率、臟器指數。

對4T1乳腺癌肺轉移的影響的測定：將在體4T1乳腺癌實體瘤組織用組織勻漿器制備單細胞懸液，調細胞數5×105/ml。0.2ml/只接種于30只BABL/c小鼠右足趾皮下，后將小鼠隨機分成三組，每組10只。接種次日開始灌胃給藥，對照組空白溶劑(0.1ml/10g)；砒霜復方實驗治療組給予砒霜復方灌胃液(0.1ml/10g)。每組10只小鼠，每日均給藥1次，連續給藥26天。治療結束次日，于小鼠內眥取血，于4℃保存3～4小時，常規取血清。后將小鼠處死，切除腫瘤、肝臟、脾臟、淋巴結、胸腺、肺，稱重。將稱重后的肺以10%福爾馬林(PBS)固定24小時，再用生理鹽水沖洗，計數肉眼可見各組肺癌轉移結節總數(個/每片)。

對4T1乳腺癌小鼠碳粒廓清能力的影響的測定^［7］：每組分別取5只小鼠作碳粒廓清，尾靜脈注射印度墨汁0.1ml/10g，然后從小鼠眼眶靜脈采血20μl，吹入2ml 0.1%NaHCO3溶液中，以等容量小鼠正常血溶于2ml 0.1%NaHCO3，溶液作為空白，用ELXS00型酶標儀630nm處測吸光度(A)，計算廓清指數K。將小鼠處死，稱脾臟、胸腺及肝臟重量，計算臟器系數。廓清指數K=(logA1-logA2)/(T2-T1)，式中A1、A2分別為1和10分鐘吸光度，T1、T2分別為1和10分鐘。臟器系數=內臟器官重量(mg)/體重(g)。

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對荷瘤小鼠體內抗氧化酶及脂質過氧化產物形成的影響的測定：①SOD的測定：腎上腺素法，腎上腺素在堿性溶液中自氧化產生的腎上腺素紅在480nm有吸收峰，SOD能抑制腎上腺素自氧化，腎上腺素自氧化減少的程度代表SOD酶的活性。②GSH-PX的測定：DTNB法，谷光甘肽過氧化物酶(GSH-PX)可以促進H2O2與還原型谷光甘肽(GSH)反應生成水及氧化型谷光甘肽(GSSG)。而GSH可以和二硫代二硝基苯甲酸(顯色劑DTNB)作用生成5一硫代二硝基苯甲酸陰離子，呈現較穩定的黃色，在412nm有最大吸收峰，以GSH消耗程度代表GSH-PX酶活性。③H2O2的測定：在辣根過氧化物酶(HRP)存在下，酚紅被過氧化氫氧化后顏色有紅變黃，當pH升至12.5左右時，黃色變為紫紅色，可保持較長時間不變，于490nm測OD值。④MDA的測定：采用TBA法。過氧化脂質降解產物中的丙二醛(MDA)可與硫代巴比妥酸(TBA)縮合，形成紅色產物，在532nm處有最大吸收峰。

統計學處理：數據以X±S表示，采用Excel進行統計分析，兩組間差異采用student’s t檢驗，P＜0.05為有顯著性差異，P＜0.01為有非常顯著性差異。

結 果

對小鼠Lewis肺癌的影響：與模型對照組比較，砒霜靜脈注射和局部注射均有明顯的抑瘤作用，減慢腫瘤的生長速度(P＜0.05)。能顯著增加脾臟、胸腺重量，脾臟指數，胸腺指數。但局部注射組小鼠體重增加不如靜脈注射組快。與模型對照組比較，砒霜靜脈注射能增加皮下移植性Lewis肺癌小鼠血清中的SOD，GSH-PX活性及機體抗MDA的能力，而砒霜局部注射還能夠增加機體的抗H2O2的能力。結果見表1，表2，圖1，圖2。對4T1乳腺癌肺轉移的影響：與模型對照組比較，砒霜復方對脾重、胸腺重、肝臟指數、脾臟指數、胸腺指數、廓清指數均增加，肺轉移結節數明顯減少，明顯降低肺結節數，但復方砒霜:青黛=1:99對肝臟指數增加沒有統計學意義。與模型對照組比較，砒霜復方能明顯增加血清中GSH-酶(P＜0.01)、SOD酶(P＜0.01)，降低血清中H2O2(P＜0.01)。與模型對照組比較，砒霜復方治療組均使小鼠體重增加，但復方砒霜:青黛=1:99組不如復方砒霜:青黛=1:49組增加明顯。結果見表3，表4，圖3。

討 論

As2O3是我國傳統中藥砒霜的有效成份之一，作為一種新型抗癌藥物，已成功地應用于人類白血病的治療^［8］，在人類多種實體腫瘤的體外實驗中證明其有良好的抑瘤效果^［9，10］。體外實驗研究顯示，As2O3可通過誘導細胞凋亡及分化等多途徑、多機制抑制卵巢癌的生長及遠處轉移^［11］。

本實驗以小鼠的臟器指數、廓清指數以及血清中GSH-X酶、MDA、SOD酶、H2O2為指標研究砒霜對小鼠皮下移植性Lewis肺癌和4T1乳腺癌的影響，結果顯示砒霜注射劑能夠抑制Lewis肺癌腫瘤的生長，但效果的強弱與用藥途徑有關。靜脈注射組腫瘤抑制率為37.29%，而局部注射組腫瘤抑制率為48.48%。但局部注射組小鼠的體重較靜脈注射組的輕，可能是因為局部注射比靜脈注射對機體的損傷強。砒霜注射劑能夠增強Lewis肺癌小鼠的脾臟指數和胸腺指數。砒霜與青黛組成的復方能夠增加4T1乳腺癌小鼠的非特異性免疫碳粒廓清指數，但作用的強弱與兩種藥物的比例有關，復方砒霜:青黛=1:49對小鼠免疫能力的增加較復方砒霜:青黛=1:99效果更好，同時對小鼠體重增加也較砒霜:青黛=1:99快。結果顯示，與模型對照組比較，砒霜注射劑和砒霜復方均能增加荷瘤小鼠體內抗氧化酶及抑制脂質過氧化產物形成，可能是砒霜能夠激活機體的免疫能力。

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