5-氮-2’-脫氧胞苷對食管癌細胞系OE33中CDH13基因甲基化的影響

摘 要 目的：觀察去甲基化制劑5-氮-2’-脫氧胞苷(5-Aza-dC)對人食管癌細胞系OE33中CDH13基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的影響，探討OE33中CDH13基因失活的機制及5-Aza-dC對CDH13基因表達的調(diào)控作用。方法：5-Aza-dC處理體外培養(yǎng)的OE33細胞，用甲基化特異性PCR(MSP)法檢測處理前后細胞中CDH13基因的甲基化狀態(tài)，半定量RT-PCR法檢測用藥前后細胞中CDH13 mRNA表達的變化。結(jié)果：OE33中CDH13啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)甲基化現(xiàn)象，應(yīng)用5-Aza-dC能使CDH13基因啟動子區(qū)CpG島去甲基化，而且經(jīng)藥物處理癌細胞后其CDH13 mRNA的表達較前明顯增強。結(jié)論：去甲基化制劑5-Aza-dC能逆轉(zhuǎn)CDH13基因甲基化狀態(tài)，從而調(diào)控CDH13基因表達。

關(guān)鍵詞 5-氮-2’-脫氧胞苷 CDH13基因 食管癌 DNA甲基化

doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2012.06.260

CDH13是鈣黏蛋白超家族中的一員，CDH13同時也是一種抑癌基因，具有強大的抗癌作用^［1］，它的缺失和腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)^［2］。5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-aza-2’-deoxycytidine，5-Aza-dC)是目前最常用且作用最強的一種甲基化抑制劑。本研究應(yīng)用5-Aza-dC干預(yù)培養(yǎng)的人食管癌細胞系OE33，觀察干預(yù)前后CDH13基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)及表達水平，為食管癌的藥物治療提供理論依據(jù)。

資料與方法

材料：①細胞系：OE33用含47.5%RPMI的1640培養(yǎng)基，加入含5%的胎牛血清的47.5%F-12，在37℃，5%CO2的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。收取細胞進行實驗，以未加藥物的細胞株作為對照。②試劑和儀器：胎牛血清和RPMI培養(yǎng)基購自GIBCO公司，5-aza-2’-deoxycytidine(Sigma公司)，RNA提取試劑及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Transzol，基因組DNA提取試劑(takara)，EZ DNA MethylationTM Kit(Zymo research)。

方法：①細胞培養(yǎng)：用含5%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基在37℃，5%CO2，飽和濕度下孵育培養(yǎng)。將細胞以適宜密度接種，加入含5-Aza-dC的RPMI培養(yǎng)基，使其藥物最終濃度5μM，每24小時更換新鮮含藥培養(yǎng)基，藥物濃度同前，連續(xù)作用5天后棄去藥液，收取細胞進行實驗，以未加藥物的細胞株作為對照。②DNA提取：用DNAiso Reagent抽提細胞株中高純度基因組DNA。紫外分光光度計測定核酸吸光度(A)值及DNA濃度。③DNA亞硫酸氫鹽修飾：按EZ DNA MethylationTM Kit說明書進行操作。最后獲得10μl TE緩沖液洗脫修飾好的DNA，-20℃保存。④RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄：按全式金公司的說明書用Transzol提取細胞RNA。經(jīng)凝膠電泳后，使用紫外分光光度儀檢測提取的總RNA的質(zhì)量和濃度，要求A260/A280≥2.0，并計算RNA含量。cDNA的合成反應(yīng)體系20μl。取Oligo(dT)(0.5μg/μl)1μl，每一標本取總RNA 1μg，2×TSReaction Mix 10μl，TransScriptTM RT/RI Enzyme Mix 1μl，用不含RNAase的水不足至總體積20μl。42℃孵育30分鐘，85℃加熱5分鐘失活TransScript。⑤引物設(shè)計和合成：CDH13上游引物：5’-TTCAGCAGAAAGTGTTCCATAT-3’；下游引物：5’-GTGCATGGACGAACAGAGT-3’^［3］。GAPDH基因上游引物：5’-ACAGTCCATGCCATCACTGCC-3’；下游引物：5’-GCCTGCTTCACCACCTTCTTG-3’^［4］。⑥PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，56℃復(fù)性30秒，72℃延伸30秒，共40個循環(huán)；72℃延伸5分鐘。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖膠分離。

統(tǒng)計學(xué)處理：用藥前后比較采用配對t檢驗。Pearson統(tǒng)計方法分析基因甲基化與其表達之間的相關(guān)性，采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包進行處理，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

5-Aza-dC作用前后人食管腺癌OE33細胞CDH13基因啟動子甲基化狀態(tài)改變：MSP法檢測用藥前后CDH13基因啟動子甲基化狀態(tài)，干預(yù)前OE33細胞呈甲基化狀態(tài)，干預(yù)后去甲基化，見圖1。

5-Aza-dC作用前后人食管腺癌OE33細胞CDH13mRNA表達水平：RT-PCR檢測用藥前后CDH13mRNA水平，干預(yù)前OE33mRNA水平低下，干預(yù)后mRNA水平明顯升高，結(jié)果見圖2。

討 論

本研究觀察了甲基化抑制劑5-Aza-dC對食管癌細胞系OE33中CDH13基因甲基化的影響。研究顯示，OE33中CDH13啟動子區(qū)存在超甲基化，用甲基化抑制劑5-Aza-dC干預(yù)后，OE33中CDH13啟動子區(qū)甲基化被逆轉(zhuǎn)，CDH13基因mRNA的表達水平增加。

特定基因的甲基化可能增加癌癥的惡性進展^［5］。CpG島超甲基化導(dǎo)致的抑癌基因失活是可以逆轉(zhuǎn)的，利用去甲基化制劑使已經(jīng)發(fā)生甲基化的基因發(fā)生去甲基化后可以重新表達，恢復(fù)抑癌基因的功能，可能為臨床治療腫瘤提供新的手段。甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT的作用是催化DNA甲基化，在CpG島異常甲基化的腫瘤細胞中多呈過表達，該酶已成為DNA去甲基化，恢復(fù)抑癌基因功能的靶分子之一^［6］。用DNMT抑制劑5-Aza-dC處理食管癌細胞后，用RT-PCR方法檢測處理前后CDH13mRNA表達水平，結(jié)果表明，5-Aza-dC處理啟動子已經(jīng)發(fā)生高度甲基化且CDH13呈低表達或者表達缺失的食管癌細胞OE33后，CDH13的表達水平明顯提高。上述結(jié)果具有很好的關(guān)聯(lián)性。這提示在CDH13表達缺失的食管癌癌細胞中，CDH13啟動子區(qū)的甲基化可能導(dǎo)致了CDH13的表達失活。DNA異常甲基化往往出現(xiàn)在腫瘤的早期，這將為腫瘤的早期診斷提供一定的依據(jù)^［7］。去甲基化制劑5-Aza-dC能逆轉(zhuǎn)CDH13基因的甲基化狀態(tài)，激活CDH13基因表達，CDH13基因可能成為食管癌的一個新靶點；5-Aza-dC有可能用于食管癌的臨床治療，為食管癌患者的診斷和治療提供了一個新途徑。

參考文獻

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