葉瓜參多糖活性成分的研究

[摘要] 目的 對葉瓜參中的多糖進行分析。 方法 應(yīng)用現(xiàn)代提取分離方法和化學(xué)及光譜鑒定技術(shù)對多糖成分進行分離鑒定。 結(jié)果 從葉瓜參中分離鑒定了CFG-1、CFG-2 和CFG-3 等3種多糖成分。 結(jié)論 CFG-1由木糖、3-甲氧基葡萄糖和葡萄糖組成，其摩爾數(shù)比=2︰1︰1；CFG-2由木糖、喹納糖、3-甲氧基葡萄糖和葡萄糖組成，其摩爾數(shù)比=2︰1︰1︰1；CFG-3由喹納糖和葡萄糖組成，其摩爾數(shù)比=1︰1。葉瓜參多糖CFG-2的PTP1B酶活性抑制試驗顯示，對PTP1B酶具有顯著的抑制活性。

[關(guān)鍵詞]海參；葉瓜參；多糖；抗糖尿病

[中圖分類號] Q74 [文獻標識碼] B [文章編號] 2095-0616（2012）21-91-02

Studies on the active polysaccharides from Cucumaria frondosa Gunnerus

ZOU Zhengrong1 CHEN Beibei1 SHAO Junjie2 JIAO Jian2 YI Yanghua3

1. Jiangxi Normal University，Live Science College，Nanchang 330000，China；2. Dalian Hai Yan Tang Biology Co.，Ltd，Dalian 116021，China；3.Second Militaly Medical University，School of Pharmacy，Research Center for Marine Drugs，Shanghai 200433，China

[Abstract] Objective To analyse the polysaccharides from Cucumber frondosa Gunnerus. Methods Apply modern methods of isolation and spectrum for identification of the polysaccharides. Results 3 of polysaccharides：CFG-1，CFG-2，and CFG-3 were isolated and identified. Conclusion The CFG-1 was composed of D-xylose，3-O-methyl-D-glucose and D-glucose（mol.rate=2︰1︰1）.CFG-2 was composed of D-xylose，L-quinovose，3-O-methyl-D-glucose and D-glucose （mol.rate=2︰1︰1︰1）. CFG-3 were composed of L-quinovose and D-glucose （mol. rate=1︰1）. CFG-2 showed significant anti-diabeties activity in the PTP1B inhibition test.

[Key words] Sea Cucumber；Cucumaria frondosa Gunnerus；Polysaccharide；Anti-diabetes

海參為海洋棘皮動物，營養(yǎng)豐富、味美可口，具有極高的藥用價值，同人參、燕窩、魚翅齊名，是世界八大珍品之一。明代以后，海參收錄于本草，作為補益藥物[1]。現(xiàn)代研究表明，海參具有提高記憶力、延緩性腺衰老、防止動脈硬化、糖尿病以及抗腫瘤等作用[2]。葉瓜參（Cucumaria frondosa Gunnerus）屬棘皮動物門（Echinodermata）、海參綱（Holothurcidea）、楯手目（Dendrochirotida）、瓜參科（Cucumariidae）的海洋動物。體長一般為50 mm，體型呈圓筒狀，體色為棕色或黑色，具有較厚的體壁和堅硬的角質(zhì)，觸手為5個。該物種廣泛分布于北極地區(qū)，俄羅斯、加拿大、挪威、英國等國海岸均有分布，此外從格陵蘭到馬薩諸塞的西大西洋水域也有分布[3]。多糖是海參的主要活性成分，主要有黏多糖巖和藻多糖兩種[4-5]。國外學(xué)者對葉瓜參中的皂苷有過研究[6-7]，但有關(guān)葉瓜參多糖的研究鮮有報導(dǎo)。本課題組先期對葉瓜參中的腦苷脂進行了研究[8]。本研究對加拿大紐西蘭海域的葉瓜參（C. frondosa Gunnerus）中的多糖成分進行了系統(tǒng)的化學(xué)分析和生物活性研究。

1 儀器與材料

1.1 實驗材料

葉瓜參新鮮樣品，2010年9月采自加拿大紐芬蘭海域，標本保存于第二軍醫(yī)大學(xué)海洋藥物研究中心。

1.2 儀器

GL-20G-Ⅱ冷凍離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；Alpha-1-2冷凍干燥儀，CHRIST（德國）；超濾裝置，上海摩速科學(xué)器材公司；BS110分析天平，Sartorius北京賽多利斯天平有限公司；BSZ-100自動餾分收集器，上海青浦滬西儀器廠； GC/MS：Finnigan Voyager GC/MS 聯(lián)用儀，配DB-5 石英毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）。HPLC條件：Aglient 1100 HPLC 儀，示差折光（RID）檢測器。

1.3 試劑

葡聚糖凝膠，Sephadex G-25 上海仕梵化學(xué)有限公司；鹽酸、硫酸、苯酚等均為分析純，由國藥集團化學(xué)試劑有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 實驗方法

2.1.1 葉瓜參多糖的提取分離 取葉瓜參新鮮樣品，冷凍干燥，粉碎成20目凍干粉。將葉瓜參凍干粉1 000 g加入5倍量的60%乙醇冷浸并攪拌5 h。離心收集上清液，沉淀物繼續(xù)按上述步驟重復(fù)提取2次，合并上清提取液，減壓濃縮，得乙醇提取物。將乙醇提取物用5倍量水溶解，Sevage法去蛋白。水層溶液減壓濃縮，冷凍干燥，即為葉瓜參粗多糖，稱重，計算其得率為5.2%。將葉瓜參粗多糖樣品溶解于25倍量的蒸餾水中，利用超濾裝置，選用不同的超濾膜（截留分子量為10 KDa、5 KDa和500 Da）對葉瓜參粗多糖進行梯度超濾，得不同分子量的截留液。減壓濃縮，冷凍干燥，得不同分子量范圍的葉瓜參多糖。

2.1.2 葉瓜參多糖的純化 所得到的樣品再分別進行葡聚糖凝膠 Sephadex G-25柱層析，蒸餾水洗脫，硫酸—苯酚法跟蹤檢測洗脫液中的多糖含量，收集均一多糖組分。從分子量為10 KDa的截留液中分離得到CFG-1（得率為5.4%）、從分子量為5 KDa的截留液中分離得CFG-2（得率為6.3%）、從分子量為500 Da的截留液中分離得CFG-3（得率為6.7%）。上述葉瓜參多糖組分經(jīng)HPGFC檢測均單一吸收峰，經(jīng)紫外掃描不含蛋白質(zhì)和氨基酸。

2.1.3 葉瓜參多糖酸水解 取已純化的葉瓜參多糖各5 mg，溶于2.5 mL三氟乙酸溶液中，置于5 mL安瓿瓶中，充氮氣后進行封管。置于水浴中加熱反應(yīng)5 h，然后取出減壓濃縮至干。加入5 mg鹽酸羥胺和吡啶1.5 mL，置于90℃水浴反應(yīng)30 min，冷卻至室溫，加入1 mL醋酐，90℃水浴反應(yīng)45 min，生成糖腈乙酸酯衍生物，溶于0.5 mL氯仿溶液，進行GC-MS分析。

GC-MS分析條件：色譜柱 HP-5石英毛細管色譜柱（30 m× 0.25 mm，0.25μm） ；柱溫 150℃（保持2 min）-300℃（保持10 min）汽化溫度 250℃；升溫速度 15℃/min；載氣（流量）氦氣（1.0 mL/min）；質(zhì)譜檢測器源溫200℃、EI電離源、電離電壓70 eV。

根據(jù)樣品測得的吸收峰的保留時間與標準糖進行對照，確定糖的組成。根據(jù)樣品測得的吸收峰的面積推測糖的摩爾數(shù)比。

2.1.4 葉瓜參多糖蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B抑制活性試驗 實驗材料和方法：應(yīng)用大腸桿菌表達后得到蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B。實驗中，以 pNPP 為底物，在96孔或384孔平底微孔板內(nèi)檢測酶活性。底物pNPP經(jīng)PTP1B水解獲得的游離產(chǎn)物在405 nm處有非常強的光吸收，通過酶標儀監(jiān)測405 nm處光吸收強度變化，計算出樣品對酶活性的抑制率（%inhibition）。

2.2 實驗結(jié)果

CFG-1由木糖、3-甲氧基葡萄糖和葡萄糖組成，其摩爾數(shù)比=2︰1︰1；CFG-2由木糖、喹納糖、3-甲氧基葡萄糖和葡萄糖組成，其摩爾數(shù)比=2︰1︰1︰1；CFG-3由喹納糖和葡萄糖組成，其摩爾數(shù)比=1︰1。

葉瓜參多糖CFG-2的PTP1B 活性抑制試驗顯示，對PTP1B酶具有顯著的抑制活性，在20μg/mL的濃度下，抑制率為（94.57±1.66）%，表明此多糖具有抗糖尿病的作用，可進一步將其應(yīng)用于抗糖尿病藥物或保健功能食品的研究開發(fā)。

[參考文獻]

[1] 樊繪曾.海參：海中人參[J].中國海洋藥物，2001，20（4）：37-44.

[2] 方積年，丁侃.天然藥物——多糖的主要生物括性及分離純化方法[J].中國天然藥物，2007，5（5）：8-12.

[3] 廖玉麟.中國動物志，棘皮動物門，海參綱[M].北京：科學(xué)出版社，1997：108-110.

[4] 方崇波.海地瓜多糖的提取和藥理作用研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2003，14（2）：76-77.

[5] 姜健，楊寶靈，邰陽.海參資源及其生物活性物質(zhì)的研究[J].生物技術(shù)通訊，2004，15（5）：537-540.

[6] Yamadaa K，Haraa E，Miyamotoa T，et al.Isolation and structure of biologically active glycosphingolipids from the sea cucumber Cucumaria echinata[J].Eur J Org Chem，1998，2：371-378.

[7] John A Findlay，Hurettin Yayli.Noval salfated oligosaccharides from the sea cucumber cucumaria frondosa[J].J Natural Products，1992，55（1）：93-101.

[8] 喇明平，邵俊杰，焦健，等. Three cerebrosides from the sea cucumber Cucumaria frondosa[J].Chinese Journal of Natural Medicines，2012，10（2）：105-109.

（收稿日期：2012-08-07）