RAW264.7細胞與脂類代謝關系的研究進展

趙麗麗，田慶龍，馮毅凡

(廣東藥學院中心實驗室，廣東 廣州 510006)

脂類物質是生物體的能量提供者，參與了大量的生命活動，具有非常重要的生理功能，包括維持細胞膜結構、能量儲藏、信號轉導和載體等[1]。美國國立衛生研究院(NIH)2003年資助的“脂質代謝途徑研究計劃”(Lipid metabolites and pathways strategy，LIPID MAPS)項目提出的脂質分類系統(The LIPID MAPS lipid classification system)，將脂質大體分為8大類，見表1[2]。

表1 脂質的分類、縮寫及數據庫中收錄的數目

由于脂類分子具有多種生物功能，脂類代謝網絡的紊亂可引起多種疾病的發生，如動脈粥樣硬化[3]、冠心病[4]、阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease)[5]、肥胖病[6]、腦損傷[7]、癌癥[8]、疼痛和炎癥[9]、糖尿病[10]等。測定脂類分子組成的改變、含量水平的變化、空間異質性和代謝轉換(Metabolic turnover)有助于解釋疾病中脂質的作用。

1 RAW264.7細胞與脂類物質的關系

1.1 RAW264.7細胞中脂類物質的含量

與其它哺乳細胞一樣，作為生命的基本單位，RAW264.7細胞中包含著眾多細胞器，每個細胞器都有其特定的功能。每個亞細胞膜上都存在著如細胞膜小凹和脂筏等微區域，共同調控著細胞的結構。哺乳細胞膜是由蛋白質和脂質分子組成的，其中蛋白質占膜質量的70%，其余為脂質分子。在多數哺乳細胞中，甘油磷脂類約占整個脂類分子的60%(以物質的量計)，糖脂類和神經鞘脂類約占整個脂類分子的10%，非極性脂(包括甘油三酯和膽固醇)在不同細胞類型和亞細胞間隔中分布范圍為0.1%～40%，類脂代謝物(如游離脂肪酸、溶血磷脂、甘油二酯、神經酰胺等)占整個脂類分子的比例不到5%，但它們在機體病變條件下能夠聚集并產生有害的病理特征。數以千計的脂質分子組成了生物膜脂雙層[11]。研究表明，哺乳動物細胞含有1000～2000種脂質，而且隨著新技術、新方法的不斷發展，各種新的脂質分子還在不斷地被發現[12]。

1.2 RAW264.7細胞中脂類物質的分布

脂雙層兩側的脂類物質的組分是不同的。其中，磷脂酰膽堿(PC)、神經鞘磷脂(SM)和膽固醇主要位于膜外側面，而磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酰絲氨酸(PS)主要位于膜胞漿側。多個亞細胞器和膜微區域的存在、脂類分子的不均勻分布以及脂類分子相互作用的內在動力學使得脂質組學的研究更具吸引力，也更有挑戰性。

1.3 RAW264.7細胞中主要脂類物質的生物學功能

甘油磷脂類中的磷脂酸(PA)是合成所有磷脂的媒介物，也是哺乳細胞內的信號分子，影響脂類代謝的多個通路；磷脂酰絲氨酸位于細胞內膜的小葉中，其在細胞表面出現是細胞凋亡的特征性標志，這對識別及清除細胞凋亡的碎片十分重要；溶血磷脂酸(LPA)在血小板聚集及癌細胞侵害時具有一定的生物活性，同時，也是G蛋白偶聯受體的天然配體；溶血磷脂酰絲氨酸主要是作為成纖維細胞趨化性的媒介；縮醛磷脂可以保護細胞防止過氧化應激；脂肪酸(FA)長鏈的氧化作為哺乳動物能量的來源；固醇類物質(類固醇激素、維他命、膽汁酸)等為機體代謝提供燃料[13，14]；神經酰胺與細胞凋亡有關；鞘氨醇-1-磷酸能夠促進細胞生長和遷移。

2 RAW264.7細胞與脂類代謝的關系

脂質組學主要研究生物體受外界刺激和疾病干擾后脂類代謝物以及脂類分子相互作用的變化。Hermansson等[15]總結出哺乳細胞中脂質處于一個穩定的狀態，繪制了在所有的哺乳細胞中都存在的甘油磷脂的生物合成和代謝的途徑，包括作用的關鍵酶。脂質代謝具有一定的代謝網絡，而網絡的紊亂可引起多種疾病的發生，通過測定細胞內脂質分子的變化(如脂種類、亞種類和單個脂類分子)、脂質分子的動態代謝以及類脂與蛋白質的相互作用，人們對許多疾病有了新的認識。因此脂質及其代謝物有望作為健康或疾病狀態的指征。脂質組學的發展為藥物開發、標記物的發現以及疾病的早期診斷提供了新的機遇[10]。

細胞是構成人體最基本的結構和功能單位，每種細胞分布于機體的特定部位，執行特殊的功能。RAW264.7細胞是小鼠單核巨噬細胞白血病細胞，屬于小鼠腹腔上皮細胞，在炎癥反應、免疫反應和吞噬反應中發揮著關鍵的作用[16]。脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分，是機體炎癥和免疫反應的強誘導劑，在啟動宿主防御細菌感染的炎癥和免疫反應中發揮重要作用。巨噬細胞經脂多糖刺激后，可以產生大量金屬基質蛋白酶(MMPs)、一氧化氮(NO)、促炎癥因子如腫瘤壞死因子(TNF-α)和白介素-6(IL-6)等，從而引發炎癥損傷[17]。為了探討該過程中脂質代謝通路，國內外學者進行了一系列的研究。

2.1 對RAW264.7細胞脂類物質代謝通路的研究

美國加州大學進行了RAW264.7細胞脂質組學的研究，研究了脂多糖誘導前后的巨噬細胞中所有脂質成分的變化[18]。以RAW264.7 細胞作為研究對象，采用一種選擇性激動該細胞的TLR4受體的物質Kdo2-Lipid A(一種脂多糖類似物)，誘導細胞成炎癥模型，系統分析了經Kdo2-Lipid A處理后8個時間點(0 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h)內，二十四烷酸類、脂肪酸類、甘油脂類、甘油磷脂類、鞘磷脂類及固醇類脂質的動態變化。結果表明，Kdo2-Lipid A處理后，脂質成分發生了很大的變化，并鑒定出400余種脂質分子，根據實驗數據，并結合相關文獻報道，LIPID MAPS 通過VANTED 軟件繪制了一系列脂質代謝途徑，如二十四烷酸類脂質代謝途徑、ω-3、ω-6、ω-9 脂肪酸的代謝途徑、含32：0、32：1、34：0、34：1、36：0、36：1、38：0、38：1、38：4 脂肪酸鏈的甘油脂類和甘油磷脂類脂質的代謝途徑、部分鞘磷脂類脂質代謝途徑、固醇類脂質代謝途徑等，并完成了對哺乳動物脂類物質的首次定量研究[19]。

2.2 對RAW264.7細胞亞細胞器脂類代謝的研究

脂質的功能是由其局部濃度決定的，脂質濃度在各細胞器之間、脂質雙分子層的2個小葉之間、甚至在細胞膜的側內面都是不同的。研究細胞脂質成分的功能，不僅要確定哪種脂質成分是存在的，還要確定每個特殊細胞部位的每種脂質的濃度及與其相互影響的成分[20]。Andreyev等[16]對RAW264.7細胞的亞細胞器脂質成分進行了研究，詳細探討了各亞細胞器中甘油磷脂類、神經鞘脂類、固醇脂類及孕烯醇脂類的提取方法及色譜質譜的分析方法，并分析了Kdo2-Lipid A誘導前后RAW264.7細胞各亞細胞器中的脂質成分，結果鑒別出163個甘油磷脂類成分、48個神經鞘脂類成分、13個固醇脂類成分及5個孕烯醇脂類成分，并進一步證明各亞細胞器間甘油磷脂類成分明顯不同，邁出了RAW264.7細胞亞細胞器脂質組學的第一步。

2.3 對RAW264.7細胞花生四烯酸類脂質代謝的研究

Gupta等[21]通過建立Kdo2-Lipid A刺激誘導的RAW264.7巨噬細胞的炎癥模型，研究了基因及藥理學干預條件下脂質通路的變化，繪制了花生四烯酸類脂質在炎癥反應中的代謝網絡，結果表明，花生四烯酸類脂質在炎癥反應中具有重要作用。Buczynski等[22]通過建立同樣的細胞模型，探討了花生四烯酸合成通路的基因組和脂質組的短暫變化，并繪制了基因組及脂質組的代謝網絡，結果表明，在Kdo2-Lipid A刺激下，首先促進COX途徑的代謝，引起大量COX途徑產物的上調、5-LOX途徑產物的下調，表明這些產物在炎癥反應中具有重要作用。因此，對花生四烯酸類脂質進行分析對了解其在健康狀態和炎癥狀態的作用及對藥物的開發都具有重要的意義。

在脂質代謝網絡中，含有二十碳四烯酸碳鏈的甘油磷脂是花生四烯酸的前體物質，Rouzer等[23]運用質譜法測定了脂多糖誘導前后，與二十碳四烯酸代謝有關的甘油磷脂的結構和兩種巨噬細胞(RPMs細胞和RAW264.7細胞)的脂質組成。結果發現，誘導前后甘油磷脂的組成有很大的不同，并與細胞種類密切相關，這表明了甘油磷脂的組成在脂質介質生物合成過程中的重要性。該實驗組隨后又進一步進行研究[24]，采用酵母多糖誘導該兩種巨噬細胞，結果表明，在脂質代謝網絡中，含有二十碳四烯酸碳鏈的磷脂酰膽堿是花生四烯酸的主要來源，而烷酰基的磷脂酰乙醇胺作為一種瞬時來源，可以快速被補充。

2.4 對RAW264.7細胞膽固醇代謝的研究

馮旭等[25]以 RAW264.7細胞為研究對象，探討人膽固醇脂水解酶(hCEH)在細胞內的瞬時表達對細胞內膽固醇代謝產生的影響，結果表明，hCEH基因在 RAW264.7細胞內成功表達，可降低細胞內膽固醇水平、抑制泡沫細胞的形成。Zhou等[26]以RAW264.7細胞源性泡沫細胞為研究對象，觀察對氧磷對RAW264.7細胞源性泡沫細胞ABCA1表達和膽固醇流出的影響并探討其機制。結果顯示，對氧磷以時間和劑量依賴的方式增加RAW264.7細胞源性泡沫細胞中總膽固醇、游離膽固醇和膽固醇脂水平，減少ABCA1表達和膽固醇流出。陶建等[27]初步探討了整合素β1基因在RAW264.7細胞攝脂過程中的作用，發現整合素β1基因明顯影響RAW264.7細胞的攝脂功能，進而影響RAW264.7細胞向泡沫細胞的轉化。

2.5 對RAW264.7細胞磷脂酶代謝的研究

細胞中磷脂的代謝同時受G蛋白和酪氨酸激酶的調控，包括磷脂酶C、D、A1和A2，另外也受到一些脂質激酶和磷酸酶的調節，這些酶可以將脂質成分轉化為生物活性的信號分子，如磷脂酸、甘油二酯和聚磷酸肌醇[28]。Zhang等[29]證實了經脂多糖誘導后的RAW264.7細胞中磷脂酶的作用。用膽堿磷脂酶C抑制劑和膽堿磷脂酶D抑制劑對誘導后的細胞作用，結果表明，該兩種抑制劑分別部分抑制脂多糖誘導的炎癥因子iNOS和TNF-α的表達，并抑制甘油二酯和磷脂酸的生成，而合用該兩種抑制劑可以達到完全阻斷的目的。因此，可以通過膽堿磷脂酶C和膽堿磷脂酶D的活性調節脂多糖誘導后的RAW264.7細胞的脂類代謝。

3 結語

結合特定的生命體、組織、體液、細胞等樣品，進行不同層面的脂質組(Lipidome)研究，使脂質代謝通路的分析具有一定的復雜性及探索性。LIPID MAPS Networks 主要是整合基因組學、蛋白質組學和脂質組學的研究結果，嘗試建立某種特定情況下的代謝途徑，是目前研究RAW264.7細胞脂類代謝最全面的機構，已鑒別出1000多種脂質分子，甚至發現了很多稀少的、以前未確定的磷脂種類。然而，不斷優化提取方法、發展新的技術和分析方法(如親和探針、生物信息學等)、探索其它未知的脂質成分及可能的代謝通路仍有待研究。另外，已發現的脂類成分中，花生四烯酸類脂質在炎癥反應中的作用已經明確，但其它脂質成分的生物學功能仍需進一步探索。鑒于脂質成分與疾病的關系，探索其與疾病相關的生物學功能將有望為疾病的治療尋找到新的靶點。

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