分光光度法測(cè)定黃花草木樨中總黃酮含量

湯春妮，閆曉前，馬喜鋒，張軍科

(陜西國防工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 西安 710302)

黃花草木樨(Melilotus)為豆科(Leguminosae)草木樨屬(MelilotusMill.)一年生或兩年生草本植物，在我國分布廣泛[1]，其全草具有抗炎抗菌、改變血管通透性、促進(jìn)血液循環(huán)、改善血管平滑肌、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化和清除自由基等藥理作用[2,3]。黃花草木樨含有香豆素類、黃酮類、酚酸類、甾體類、三萜類、糖類、蛋白質(zhì)類等化學(xué)成分，其中黃酮類化合物是主要功效成分之一[4～8]。目前，國內(nèi)對(duì)黃花草木樨中總黃酮含量測(cè)定方法的研究報(bào)道甚少[9]。分光光度法常用來測(cè)定植物中總黃酮含量。黃酮類化合物本身在紫外光譜區(qū)具有吸收帶，但存在較多干擾，故通過NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 比色法[即黃酮類化合物在亞硝酸鹽存在的堿性條件下與Al(NO3)3形成穩(wěn)定的紅色配合物]使其吸收帶位移至可見光區(qū)進(jìn)行測(cè)定，以較少干擾測(cè)得以蘆丁為標(biāo)樣的總黃酮含量。作者采用分光光度法測(cè)定黃花草木樨中總黃酮的含量，以期為黃花草木樨中總黃酮的開發(fā)提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試藥、試劑與儀器

蕓香葉苷(蘆丁)，生化級(jí)，中國醫(yī)藥上海化學(xué)試劑公司；其余所用試劑均為分析純；市購草木樨，經(jīng)鑒定為黃花草木樨M.officinalisL.Desr。

UV-9200型紫外可見分光光度計(jì)，北京瑞利分析儀器公司；BP211D型電子天平，SARTORLUS；DF-101S型集熱式恒熱加熱磁力攪拌器，上海東爾制冷儀器設(shè)備有限公司；KQ3200型超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；LDA-2型低速離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠。

1.2 供試品溶液的制備

方法一(熱回流提取法)：精密稱取粉碎過篩的草木樨藥材1.0000 g，加入30 mL 80%甲醇溶液，在60 ℃下回流提取2 h，離心分離，共提取3次，合并濾液定容至100 mL作為供試品溶液備用。

方法二(超聲波提取法)：精密稱取粉碎過篩的草木樨藥材1.0000 g，加入30 mL 80%甲醇溶液，常溫下超聲提取40 min，離心分離，共提取3次，合并濾液定容至100 mL作為供試品溶液備用。

方法三(冷浸提取法)：精密稱取粉碎過篩的草木樨藥材1.0000 g，加入30 mL 80%甲醇溶液，常溫下提取24 h(前6 h時(shí)時(shí)振搖，后18 h靜置)，離心分離，共提取3次，合并濾液定容至100 mL作為供試品溶液備用。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[10,11]

精確稱取蘆丁10.0 mg(105 ℃烘干至恒重)，用80%的甲醇溶解并定容至100 mL，得0.1 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，備用。精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL置于10 mL容量瓶中，分別加入5% NaNO2溶液0.3 mL，靜置6 min，再分別加入10% Al(NO3)3溶液0.3 mL，靜置6 min，最后加入4% NaOH溶液4 mL，用甲醇定容至10 mL，靜置20 min；以相應(yīng)試劑為空白，用紫外可見分光光度計(jì)在510 nm處測(cè)定吸光度值。結(jié)果表明，蘆丁在10～50 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)，吸光度值與濃度呈良好的線性關(guān)系：A=0.0128c-0.0194(R=0.9992)。

1.4 樣品含量的測(cè)定

分別精密吸取按1.2項(xiàng)方法制備的供試品溶液2.0 mL置于10 mL容量瓶中，按1.3項(xiàng)操作，測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 精密度實(shí)驗(yàn)

精密量取6份蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各3.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，按1.3項(xiàng)操作，測(cè)定吸光度分別為0.372、0.373、0.371、0.375、0.372、0.371，平均值為0.372，RSD=0.41%。表明方法的精密度良好。

2.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密吸取供試品溶液2.0 mL，置于10 mL容量瓶中，按1.3項(xiàng)操作，每隔10 min測(cè)定1次吸光度，共測(cè)6次，吸光度分別為0.348、0.347、0.346、0.344、0.343、0.341，平均值為0.345，RSD=0.77%。表明供試品溶液在顯色后60 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取同一批草木樨藥材6份，按1.2項(xiàng)方法一制備供試品溶液，精密吸取制備的供試品溶液2.0 mL，置于10 mL容量瓶中，按1.3項(xiàng)操作，測(cè)定吸光度分別為0.346、0.349、0.345、0.344、0.340、0.343，平均值為0.345，RSD=0.88%。表明方法的重現(xiàn)性良好。

2.4 回收率實(shí)驗(yàn)

精密量取9份已知含量的供試品溶液(方法一)1.0 mL至10 mL容量瓶中，再分別準(zhǔn)確加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.1 mL、1.4 mL、1.8 mL，進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)，每組3份，按1.3項(xiàng)操作，分別測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

由表1數(shù)據(jù)計(jì)算，平均回收率為99.19%、RSD為0.79%，表明方法的回收率良好。

2.5 樣品含量測(cè)定

按1.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，精密吸取2.0 mL置于10 mL容量瓶中，按1.3項(xiàng)操作，分別測(cè)定吸光度，結(jié)果見表2。

由表2可知，與超聲波提取法、冷浸提取法相比，熱回流提取法提取黃花草木樨中總黃酮的效果最好，其平均含量為1.44%，這可能與黃花草木樨中含有的黃酮類化合物的種類與結(jié)構(gòu)有關(guān)。因此， 確定熱回流提取法為測(cè)定黃花草木樨中總黃酮時(shí)的提取方法。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 不同提取方法的總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

采用分光光度法測(cè)定黃花草木樨中總黃酮含量，操作簡便、準(zhǔn)確、可靠、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，可用于黃花草木樨中總黃酮的含量測(cè)定。

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