赤霉素產生菌原生質體理化誘變-定向篩選模型的建立與應用

張文宣，趙 南，張金兒，朱江萍，劉義雄

(江西新瑞豐生化有限公司，江西 新干 331307)

赤霉素(俗稱920)屬于植物五大激素之一，是一種高效植物生長調節劑，能迅速地刺激植物的生長發育，促進植物提早開花結實，有效地打破植物種子、塊莖的休眠期，促進萌發，誘導單性結實，減少棉花花蕾脫落等，在農、林、園藝等方面具有廣泛的用途。隨著赤霉素在啤酒生產、蔬菜水果、農林畜牧等應用領域的進一步拓展，其市場前景將更廣闊。

赤霉素在我國已有近40年的生產歷史，早期有較多生產水平低的專利和基礎研究文獻報道[1]，偶見一些綜述性文獻[2]，實際應用研究報道卻很少，20世紀70年代成功地篩選到4303高產菌株[3]，促進了赤霉素生產的發展。隨著微生物細胞工程的研究與發展，原生質體的形成、再生、融合與定向篩選技術越來越多地應用在微生物的育種過程中。李武軍等[4]建立了藤倉赤霉菌原生質體形成與再生技術；劉冬華等[5]進行了原生質體的紫外線誘變育種研究。

作者在借鑒上述研究的基礎上，對赤霉素原生質體的制備純化工藝進行改進，并利用定向篩選機理，建立了赤霉素產生菌的誘變篩選模型，應用于抗藥性突變高產菌株的篩選工作，取得了良好效果。

1 實驗

1.1 菌株、試劑和培養基

出發菌株：藤倉赤霉菌4303-N菌株。

高滲溶液：0.7 mol·L-1NaCl溶液。

纖維素酶、蝸牛酶、果膠酶均為上海產，其余試劑均為CP或AR級。

斜面培養基(MM)：葡萄糖、硝酸鉀、瓊脂等。

菌絲生長培養基(MGM)：葡萄糖、甘氨酸、瓊脂等。

再生培養基(RM)：蔗糖、酵母膏等。

抗性再生培養基(RRM)：在 RM培養基中添加抗性物質。

種子培養基(SM)：葡萄糖、糊精等。

發酵培養基(FM)：玉米淀粉、花生粉、黃豆粉等。

1.2 方法

1.2.1 幼嫩菌絲體的制備

從新鮮斜面上挑取少量菌絲體，放入含有石英砂、玻璃珠、生理鹽水的無菌三角瓶中，搖床振蕩10～20 min，得到菌絲斷片懸浮液，用1 mL無菌吸管吸取菌絲斷片懸浮液點種在平鋪于MGM平板上的濾膜紙表面，每個平板點種1 mL(約50～80滴)，28 ℃培養1～2 d可見薄層白色菌絲時，即為幼嫩菌絲體。

1.2.2 原生質體的制備

將長有幼嫩菌絲體的濾膜紙輕輕揭下，在混合酶液中將幼嫩菌絲體漂洗下來，于28 ℃進行酶解，在酶解過程中，間歇搖動使酶解充分,定時取樣，在生物顯微鏡下觀察原生質體的形成并計數。菌絲及原生質體混合物經1500 r·min-1離心10 min，沉淀除去殘留酶液,再用高滲溶液洗滌2次，用G2漏斗或脫脂棉過濾除去大部分菌絲斷片，即得原生質體懸浮液。

1.2.3 原生質體的誘變

UV誘變：取原生質體懸浮液約5 mL加入無菌平皿內,置于已預熱30 min的UV燈(15 W，波長253.7 nm)直下30 cm處，開蓋振蕩照射100 s左右。

NTG誘變：取原生質體懸浮液分別用25 μg·mL-1、50 μg·mL-1、75 μg·mL-1、100 μg·mL-1NTG處理30 min，以大量稀釋法終止反應。上述處理均在避光條件下進行。

取誘變處理后的原生質體懸浮液分別涂布在含致死濃度的抗生素再生平板和不含抗生素再生平板上，28 ℃恒溫培養7～12 d，使抗藥性突變菌株得到再生，分別統計其再生菌落數，計算致死率和突變率。

×100%

×100%

正變率為：發酵單位≥110%的正變株占總篩選菌株的百分率。

1.2.4 原生質體的定向再生

取誘變處理后的原生質體懸浮液，用高滲溶液適當稀釋后，分別涂布于RM平板(測定存活率)和RRM平板上，于28 ℃恒溫培養6～8 d，使抗藥性突變菌株得到再生。同時取兩份未經誘變處理的原生質體懸浮液，一份用高滲溶液稀釋后，涂布于RM平板上作存活率對照測定；另一份用無菌水稀釋以休克原生質體，涂布于RM平板上作再生率對照測定。

×100%

經實驗測定,原生質體在RM再生培養基上的再生率為16%左右，待抗性再生培養平板上長出抗藥性單菌落后，分別接種于MM斜面試管上，繼續培養3～4 d，置于4 ℃冰箱中待篩選。

1.2.5 抗藥性突變高產菌株的搖瓶篩選

將抗藥性菌株進行搖瓶初篩和復篩。初篩為一級發酵,即從斜面上挖塊直接種入發酵搖瓶中。復篩為二級發酵，即將斜面上菌種挖塊種于種子搖瓶中于旋轉式搖床上28 ℃培養30～50 h，種子液長濃后，以8%～10%移種到發酵搖瓶中。初篩和復篩的發酵搖瓶均于28 ℃搖床培養8 d后，放瓶檢測發酵濾液的效價。

1.2.6 效價測定

參照文獻[3]。

1.2.7 配方優化

將種子或發酵原有配方中的碳源、氮源、無機鹽等各設計2～4個濃度梯度，通過正交設計及結果分析，確定各成分的具體配比。

2 結果與討論

2.1 赤霉菌原生質體制備工藝的改進

針對赤霉菌絲為不產孢子的多核菌絲的特性，用復合破壁酶液(纖維素酶2%+蝸牛酶1%+果膠酶0.4%)對其進行處理，使菌絲細胞壁酶解破壁釋放出游離的單核體(原生質體)，然后再進行誘變育種。通過混合酶液組分配比的優化調整，進一步完善了原生質體的制備純化工藝。實驗表明：采用微孔濾膜作載體、含甘氨酸的菌絲生長培養基、以幼嫩菌絲體為對象、經復合破壁酶液酶解等新工藝，能使原生質體的釋放量提高一個數量級，并且其再生活性明顯得以增強。正是由于原生質體制備工藝的完善與成熟，從而確保了基因突變后的遺傳個體絕大部分都是純合體，避免了高產性狀經傳代后水平回復的現象。

2.2 理化誘變劑誘變劑量的選擇

2.2.1 物理誘變劑UV照射劑量的選擇(表1)

表1 UV照射時間對赤霉素原生質體致死率的影響

從表1可以看出，隨著UV照射時間的延長，原生質體的致死率增大。選擇存活率在10%～20%左右，即UV照射時間90～120 s左右為原生質體的UV照射劑量。

2.2.2 化學誘變劑NTG誘變劑量的選擇[6](表2)

表2 NTG誘變劑量對赤霉菌原生質體的致死率及誘變效果的影響

從表2可以看出，隨著NTG誘變劑量的增加，其原生質體的致死率增大，正變率相應降低。選擇正變率大、致死率超過50%的NTG誘變劑量，即25 μg·mL-1處理30 min左右為其作用劑量。

2.3 赤霉素原生質體抗藥性致死突變標志誘變篩選模型的建立

單核的原生質體經過理化因子(如UV、NTG等)誘變處理后，絕大部分仍保持原有的遺傳穩定性或被誘變劑直接殺死，能發生基因突變的幾率相當小，而變異又大多產生負變，所需要的正突變個體就更少,如果采用傳統的隨機篩選法來篩選高產菌株，難以取得成功。在此采用定向篩選技術來濃縮突變型、陶汰野生型,使正變菌株得到定向再生，而負變菌株不能再生，從而大大地節省人力物力，極大地提高篩選效率。

2.3.1 定向篩選機理

抗生素產生菌在發酵過程中，當抗生素積累超過一定濃度時會導致產生菌的自殺，產生菌通過反饋抑制和反饋阻遏來限制抗生素的過量積累，進行代謝的自我調節，從而保護菌株本身[7]，由此可將赤霉菌自身產生的赤霉素作為抗性篩選物質；另外，在抗生素產生菌的遺傳物質中，抗性基因與抗生素合成的結構基因和調控基因緊密連鎖，因而各基因之間易發生共突變[8]，由此也可選擇其它對赤霉素菌體有抑制殺菌作用的敏感抗生素(如氯霉素)作為抗性篩選物質[6]。產生菌經誘變后如能在較高濃度的赤霉素、氯霉素等抗性篩選物質存在的環境中生存，就能解除抗生素的反饋抑制和反饋阻遏，這樣的菌株將能合成更多的抗生素。

2.3.2 抗性篩選物質赤霉素、氯霉素亞致死濃度的選擇

將赤霉素、氯霉素分別制成0～4000 μg·mL-1的濃度梯度板，將制備好的原生質體懸浮液按每皿0.1 mL均勻涂布在該濃度梯度板上，28 ℃恒溫培養4～5 d，根據再生平板上菌落生長情況，推算出赤霉素、氯霉素的大致亞致死濃度分別是3000 μg·mL-1左右和2000 μg·mL-1左右，再以此濃度為中心濃度，以100 μg·mL-1為一檔次，分別向上遞增和向下遞減制成系列濃度平板，精確測定出赤霉素亞致死濃度為2800 μg·mL-1、氯霉素亞致死濃度為2000 μg·mL-1。

2.3.3 誘變篩選模型的建立

依據定向篩選機理，以亞致死濃度作為抗性篩選物質的加入濃度，將2800 μg·mL-1的赤霉素或2000 μg·mL-1的氯霉素準確加入到赤霉素原生質體再生培養基(RM)中，成為抗性再生培養基(RRM)，建立赤霉素產生菌原生質體抗藥性致死突變標志的誘變篩選模型，通過RRM抗性再生培養基，進行定向篩選，真正達到了濃縮突變型、陶汰野生型的效果。

2.3.4 誘變篩選模型的應用

依據所建立的赤霉素產生菌原生質體抗(耐)藥性致死突變標志的誘變篩選模型，進行赤霉素菌種的誘變改良，獲得了N7298等多株高產誘變菌株，并推廣應用于赤霉素的工業化生產。選育系譜如下：

2.4 發酵工藝的優化

高產誘變菌株與出發菌株相比，遺傳基因發生了較大變化，生理、生化等遺傳特征表現出一定差異，原有的發酵工藝已不能適應其生長需要，影響了其高產性能的充分表達。采用正交實驗法、方差分析法、濃度梯度法、回歸分析法等優化發酵配方和完善發酵工藝。通過多次配方優化，得到N7298的優化配方為：發酵培養基：碳源一3%，碳源二9%，氮源一1.2%，氮源二0.6%，無機鹽一0.1%，無機鹽二0%，無機鹽三0.1%。無機鹽二不宜加入，其它成分不變。以優化配方與原配方對N7298進行對比實驗，結果見表3。

2.5 高產誘變菌株N7298的搖瓶小試與大罐試產結果

表3 優化配方與原配方搖瓶小試對比結果/%

表4 N7298與出發菌株N的效果對比/%

由表4可知，N7298菌株無論是搖瓶小試還是大罐(20 m3)試產的產量都較出發菌株N提高24%左右。如果以年產赤霉素80 t計，則年新增產量19.2 t，年新增利稅960萬元 (以每千克新增產品降低發酵成本500元計算)，經濟效益非常顯著。

3 結論

應用所建立的赤霉素誘變篩選模型，進行產生菌原生質體理化誘變-定向篩選，成功得到N7298等多株原生質體再生的抗藥性突變高產菌株。N7298的搖瓶效價比出發菌株N提高23.4%、20 m3罐生產水平提高24.1%。

N7298高產誘變菌株的成功選育，為今后進一步應用誘變篩選模型、開展赤霉素選育的定向篩選工作積累了經驗，且對其它抗生素產生菌的誘變篩選工作具有較廣泛的借鑒意義。

參考文獻：

[1] Jefferys E G.The gibberellin fermentation[J].Advances in Appl Microbiol,1970,13:283-316.

[2] 顏亨宸,宋友禮.赤霉素研制概況[J].抗生素副刊,1989，(5):10-19.

[3] 上海“九二○”菌種選育協作組.九二○產生菌4303高產株的選育[A].微生物育種學術討論會文集[C].北京：科學出版社，1975:61-65.

[4] 李武軍,鄭幼霞,王洪洲,等.赤霉素產生菌藤倉赤霉菌原生質體的形成與再生[J].真菌學報,1992,11(3):221-228.

[5] 劉冬華,李伯邁,鄧云珍,等.赤霉素產生菌原生質體的紫外線誘變育種[J].湖南微生物學通訊,1992，(1):15-17.

[6] 張金兒,朱江萍,劉義雄.從氯霉素抗性突變株篩選赤霉素高產菌株[J].中國抗生素雜志,2005，(5)：301-303.

[7] 盛祖嘉.微生物遺傳學[M].北京:科學出版社,1984:467-468.

[8] 涂國全,劉姝,黎循航.梅嶺霉素高產菌株鏈霉爛抗生基因突變株篩選[J].微生物學通報,2002，(6):33-37.