豌豆肌動(dòng)蛋白異型體PEAc3基因的克隆及生物信息學(xué)分析

張少斌，王 粲，劉 慧，劉 曦

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866)

肌動(dòng)蛋白(Actin)是真核生物中普遍存在的一種古老的蛋白質(zhì)，是構(gòu)成細(xì)胞骨架的主要成分，也是維持細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ)。Actin最早在動(dòng)物骨骼肌細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，我國(guó)科學(xué)家閻隆飛等[1]首次證明了植物Actin的存在。在細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白(Actin binding proteins，ABPs)調(diào)控下，Actin微絲的長(zhǎng)度、極性、穩(wěn)定性和三維結(jié)構(gòu)處于動(dòng)態(tài)變化之中，并將Actin纖維與細(xì)胞漿和細(xì)胞膜的其它成分相連接，從而調(diào)節(jié)Actin的理化狀態(tài)，藉以完成多種細(xì)胞功能，包括細(xì)胞分裂[2]、內(nèi)吞作用[3]、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)[4,5]、重力感應(yīng)[6,7]、細(xì)胞頂端生長(zhǎng)[8,9]、細(xì)胞器運(yùn)動(dòng)[10～12]等。

近年來(lái)，人們陸續(xù)從高等動(dòng)植物體中克隆了Actin基因，并分離純化出許多肌動(dòng)蛋白異型體。通過(guò)對(duì)擬南芥Actin基因家族的系統(tǒng)發(fā)育分析，將它們分成營(yíng)養(yǎng)型肌動(dòng)蛋白(Vegetative actin)和生殖型肌動(dòng)蛋白(Reproductive actin)，其表達(dá)具有明顯的組織特異性，并且在大多數(shù)組織和器官中往往同時(shí)大量表達(dá)著兩種以上的肌動(dòng)蛋白異型體[13]，且不同肌動(dòng)蛋白異型體的表達(dá)具有時(shí)空的特異性，發(fā)揮作用也不盡相同。

作者在此采用RT-PCR技術(shù)克隆了豌豆肌動(dòng)蛋白異型體PEAc3完整編碼區(qū)的cDNA序列，并作了生物信息學(xué)分析，推斷了編碼蛋白的結(jié)構(gòu)，擬為進(jìn)一步研究其結(jié)構(gòu)與其生物學(xué)作用之間的聯(lián)系奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料及主要試劑

豌豆(Pisumsativum.)卷須采自溫室培養(yǎng)的豌豆植株；大腸桿菌DH5α、質(zhì)粒pET-30，實(shí)驗(yàn)室保存；克隆載體pGEM-T easy，Promega公司；dNTP、Taq聚合酶、膠回收試劑盒、TRizol，Takara公司；其它試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

引物合成及測(cè)序由上海生工生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 肌動(dòng)蛋白基因克隆與測(cè)序

總RNA提取采用TRizol法，0.1 g卷須加入1 mL TRizol。參照張少斌等[14]的RT-PCR方法，首先將mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)NCBI檢索到的PEAc3序列，設(shè)計(jì)引物如下：

上游：GC GAATTC ATGGCAGAATCCGA-AGATAT(EcoRI)；下游：GC GGTACC GAAGCATTTCCTGTGTAC(KpnI)。

反應(yīng)條件為：95 ℃熱變性5 min，94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃下延伸10 min，4 ℃保存。

PCR反應(yīng)結(jié)束后，采用瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。參照DNA膠回收純化試劑盒說(shuō)明，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性片段進(jìn)行膠回收，與pGEM-T easy載體連接，轉(zhuǎn)化，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，隨機(jī)挑取白斑進(jìn)行PCR和酶切鑒定，鑒定正確的菌株送上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.3 肌動(dòng)蛋白生物信息學(xué)分析

應(yīng)用DNAMAN 6.0生物學(xué)軟件查找測(cè)序得到的核苷酸序列的開(kāi)放讀碼框，將PEAc3基因的核酸序列翻譯成氨基酸序列，并進(jìn)行多序列比對(duì)，應(yīng)用生物信息學(xué)軟件對(duì)氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)與功能分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 PEAc3的克隆與鑒定

RT-PCR產(chǎn)物的質(zhì)量是關(guān)系到最后能否得到正確序列的關(guān)鍵因素，從豌豆總RNA中通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增PEAc3的序列結(jié)果見(jiàn)圖1A。

A.RT-PCR擴(kuò)增PEAc3 B.重組載體的PCR鑒定 C.重組載體的雙酶切鑒定

由圖1A可知，條帶清晰，大小在1000 bp左右，與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)登記的大小一致。將擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收后連接到pGEM-T easy克隆載體，構(gòu)建重組載體pGEM-T-PEAc3，經(jīng)PCR鑒定(圖1B)和酶切鑒定(圖1C)正確后，送到上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

2.2 PEAc3序列同源性分析

經(jīng)序列測(cè)定，應(yīng)用DNAMAN軟件分析核酸序列測(cè)序結(jié)果，證實(shí)為具備完整開(kāi)放閱讀框的肌動(dòng)蛋白基因，并推測(cè)了其氨基酸序列，與Genbank中注冊(cè)的PEAc3序列相比，只有2個(gè)氨基酸的差異，分別是328位的S變?yōu)镮、349位的A變?yōu)镾，具體序列如圖2所示。

圖2 克隆的PEAc3氨基酸序列

肌動(dòng)蛋白基因家族是一個(gè)多基因家族，一般具有多個(gè)拷貝，碗豆肌動(dòng)蛋白基因家族進(jìn)化關(guān)系比較見(jiàn)圖3。

圖3 豌豆肌動(dòng)蛋白基因家族進(jìn)化關(guān)系比較

由圖3可知，通過(guò)RT-PCR克隆出的PEAc3基因(圖3中標(biāo)注為PEAc3 RT-PCR)與Genbank中注冊(cè)豌豆肌動(dòng)蛋白家族基因序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，與PEAc9、PEAc12及PEAc3基因注冊(cè)序列的親緣關(guān)系較近，這與它們同屬于同一類(lèi)基因家族PEAcⅡ相一致，其中與注冊(cè)的PEAc3同源性最高，為99%。而因PEAc3基因與PEAc1、PEAc17、PEAc14屬于不同的豌豆肌動(dòng)蛋白異型體類(lèi)別，相應(yīng)的進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。

將PEAc3與在NCBI文庫(kù)中檢索到的100多種植物Actin基因進(jìn)行序列比對(duì)，同源性高達(dá)89.07%，而且在位點(diǎn)339和350處都是高度保守的，僅同屬豌豆PEAcⅡ類(lèi)肌動(dòng)蛋白基因家族的6條注冊(cè)序列PEAc3(AAB18641和AAB38511)、PEAc9(AAB18642和AAB38512)和PEAc11(AAB18643和AAB38513)在該位點(diǎn)存在差異。

在檢索到的Actin氨基酸序列中隨機(jī)選擇8條(包括PEAc3在內(nèi)，還有綠豆、擬南芥、大麥、大豆、煙草、獼猴桃和三葉草)比較同源性，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 PEAc3與其它7種植物Actin基因的氨基酸序列同源性的比較/%

由表1可看出，PEAc3基因與綠豆的肌動(dòng)蛋白基因親緣關(guān)系較近，這與系統(tǒng)分類(lèi)學(xué)中豌豆與綠豆同屬于豆科相一致，但是與大豆親緣關(guān)系則相對(duì)較遠(yuǎn)。其次是與禾本科的大麥親緣關(guān)系相對(duì)較近，肌動(dòng)蛋白在真核生物種內(nèi)與種間基因存在著不同程度的變異，而且存在大量的肌動(dòng)蛋白異型體，這使得在分子水平上研究植物界的肌動(dòng)蛋白基因的進(jìn)化規(guī)律較為困難。

2.3 PEAc3序列指紋圖譜分析(圖4)

圖4 PEAc3序列指紋圖譜分析

應(yīng)用DNAMAN6.0推測(cè)長(zhǎng)度為1134 bp的PEAc3核酸序列，得到了長(zhǎng)度為377的氨基酸序列。經(jīng)疏水性、SignalP 3.0、ProtParam和ScanProfile程序分析推斷，PEAc3分子量為41 668.7 Da，理論等電點(diǎn)為5.31，帶正電的氨基酸殘基(Arg+Lys)數(shù)為38個(gè)，帶負(fù)電的氨基酸殘基(Asp+Glu)數(shù)為50個(gè)。PEAc3是由3組序列指紋圖譜(Signature)組成的一組序列模體，沒(méi)有信號(hào)肽部分，以成熟蛋白形式存在，經(jīng)SOSUI程序分析推測(cè)該肌動(dòng)蛋白為可溶性蛋白。

2.4 PEAc3疏水性分析

疏水性分析結(jié)果顯示，疏水性最高比值為2.300，親水性最高比值為2.200(比值浮動(dòng)范圍為4，數(shù)值越高表示該特性越強(qiáng))，應(yīng)用TMHMM 2.0程序?qū)Φ鞍變?nèi)部跨膜區(qū)的預(yù)測(cè)與疏水性結(jié)果基本相符。預(yù)測(cè)蛋白可能的跨膜區(qū)有3個(gè)或2個(gè)，位于氨基酸序列位點(diǎn)137～157、304～322和348～366(N端開(kāi)始)，但是第二個(gè)區(qū)域304～322位點(diǎn)間的疏水性不是很強(qiáng)，程序預(yù)測(cè)也可能是2個(gè)跨膜區(qū)，位于氨基酸序列位點(diǎn)141～157和348～366。

2.5 討論

除了ACTINS_1上結(jié)合一些小分子，ACTINS_2高度保守的色氨酸也與N端谷氨酸共同作用結(jié)合Ca2+、天冬氨酸結(jié)合Sr2+，這些結(jié)合能力為PEAc3在體內(nèi)發(fā)揮細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能奠定了決定性的基礎(chǔ)。同時(shí)色氨酸也是熒光素RHO通過(guò)范德華力結(jié)合的位點(diǎn)，所以推測(cè)這也可能是鬼筆環(huán)肽法活體標(biāo)記微絲后不能解聚及無(wú)法標(biāo)記單體肌動(dòng)蛋白的原因。Ca2+存在下微絲解聚成單體肌動(dòng)蛋白，熒光素與Ca2+共同競(jìng)爭(zhēng)色氨酸位點(diǎn)，若熒光素競(jìng)爭(zhēng)力強(qiáng)，則Ca2+無(wú)法再結(jié)合，微絲不能解聚；而當(dāng)Ca2+存在下，ACTIN以單體形式存在，鬼筆環(huán)肽標(biāo)記物也無(wú)法再結(jié)合。

ACTINS_ACT_LIKE序列中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何配體的結(jié)合位點(diǎn)，它折疊纏繞在三維結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，作為保守的序列指紋圖譜很可能起到不可取代的結(jié)構(gòu)支撐作用。有趣的是這段序列是Actin和肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白共有的序列指紋圖譜，其意義目前還無(wú)法解釋清楚。

PEAc3屬于豌豆肌動(dòng)蛋白家族的Ⅱ類(lèi)異型體，主要在幼嫩組織中表達(dá)。以上只是在Actin結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上的功能預(yù)測(cè)，在具體的時(shí)空中如何表達(dá)，真正發(fā)揮哪些作用還需要對(duì)該蛋白及其結(jié)合蛋白進(jìn)一步深入研究。

3 結(jié)論

根據(jù)NCBI文庫(kù)中檢索到的序列，采用RT-PCR技術(shù)克隆了豌豆肌動(dòng)蛋白異型體PEAc3完整編碼區(qū)的cDNA序列，基因全長(zhǎng)1134 bp，開(kāi)放閱讀框編碼377個(gè)氨基酸。氨基酸序列分析表明，該基因的編碼蛋白PEAc3為可溶性蛋白，分子量41 668.7 Da，沒(méi)有信號(hào)肽部分，呈酸性，PEAc3包括ACTINS_1(編號(hào)：PS00406)、ACTINS_ACT_LIKE(編號(hào)：PS01132)以及ACTINS_2(編號(hào)：PS00432)3組肌動(dòng)蛋白序列指紋圖譜(Signature)。序列同源性分析表明PEAc3與其它上百種植物肌動(dòng)蛋白同源性高達(dá)89.07%。

參考文獻(xiàn)：

[1] 閻隆飛,石德權(quán).高等植物中的收縮蛋白[J].生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，1963，(3)：490-495.

[2] Roberto A B，Masaaki U，Saburo Y,et al.Arabidopsis CAP regulates the actin cytoskeleton necessary for plant cell elongation and division[J].Plant Cell，2002，14(1):149-163.

[3] Baluska F, Hlavacka A, Samaj J, et al.F-Actin-dependent endocytosis of cell wall pectins in meristematic root cells.Insights from brefeldin A-induced compartments[J].Plant Physiology，2002，130(1):422-431.

[4] Balasubramanian R,Karve A,Kandasamy M,et al.A role for F-actin in hexokinase-mediated glucose signaling[J].Plant Physiology，2007，145(4):1423-1434.

[5] Staiger C J,Franklin-Tong V E.The actin cytoskeleton is a target of the self-incompatibility response inPapaverrhoeas[J].Journal of Experimental Botany，2003，54(380)：103-113.

[6] Yamamoto K，Kiss J Z.Disruption of the actin cytoskeleton results in the promotion of gravitropism in inflorescence stems and hypocotyls ofArabidopsis[J].Plant Physiol，2002,128(2)：669-681.

[7] Palmieri M,Kiss J Z.Disruption of the F-actin cytoskeleton limits statolith movement inArabidopsishypocotyls[J].Journal of Experimental Botany，2005，56(419):2539-2550.

[8] Fu Y,Wu G,Yang Z B,et al.Rop GTPase dependent dynamics of tip-localized F-actin controls tip growth in pollen tubes[J].Cell Biology，2001，152(5):1019-1032.

[9] Gu Y，F(xiàn)u Y，Dowd P，et al.A Rho family GTPase controls actin dynamics and tip growth via two counteracting downstream pathways in pollen tubes[J].Cell Biology，2005,169(1):127-138.

[10] Maisch J,Nick P.Actin is involved in auxin-dependent patterning[J].Plant Physiology，2007，143(4):1695-1704.

[11] Chen T，Teng N J，Wu X Q,et al.Disruption of actin filaments by latrunculin B affects cell wall construction inPiceameyeripollen tube by disturbing vesicle trafficking[J].Plant and Cell Physiology，2007，48(1):19-30.

[12] Gestel K V，Kohler R H，Verbelen J P.Plant mitochondria move on F-actin，but their positioning in the cortical cytoplasm depends on both F-actin and microtubules[J].Journal of Experimental Botany，2002，53(369):659-667.

[13] Meagher R B，McKinney E C，Kandasamy M K.Isovariant dynamics expand and buffer the responses of complex systems：The diverse plant actin gene family[J]．Plant Cell,1999,11(6)：995-1005

[14] 張少斌,任東濤,徐小靜,等.豌豆肌動(dòng)蛋白異型體(PEAc1)與綠色熒光蛋白融合基因的原核表達(dá)與特性分析[J].科學(xué)通報(bào),2004，49(6):563-569.

[15] Kim H，Park M，Kim S J，et al.Actin filaments play a critical role in vacuolar trafficking at the golgi complex in plant cells[J].The Plant Cell，2005，17(3)：888-902.

[16] Mathur J，Mathur N，Hulskamp M.Simultaneous visualization of peroxisomes and cytoskeletal elements reveals actin and not microtubule-based peroxisome motility in plants[J].Plant Physiol，2002，128(3)：1031-1045.