發(fā)酵法生產輔酶Q10研究進展*

鄭 毅 王 婭 朱志春 邱婷玉 陳 燕

發(fā)酵法生產輔酶Q10研究進展*

鄭 毅 王 婭 朱志春 邱婷玉 陳 燕

福建師范大學生命科學學院

輔酶Q10是一種重要的生化藥物，主要生產方法有直接提取法、化學合成法與微生物發(fā)酵法，其中，微生物發(fā)酵法是最有前途的生產方法。該文綜述了微生物發(fā)酵生產輔酶Q10的研究進展，內容包括輔酶Q10的生產菌種、高產菌株的選育手段、發(fā)酵培養(yǎng)基與發(fā)酵條件對輔酶Q10發(fā)酵的影響。

輔酶Q10微生物發(fā)酵法 研究進展

1 概述

輔酶Q10是一種脂溶性的醌類化合物，化學名稱為2,3-二甲氧基-5-甲基-6-癸異戊烯基-1，4-二苯醌，別名癸烯醌、泛醌，分子式為C59H90O4，分子量為863.36，在室溫下呈橙黃色結晶，無臭無味。輔酶Q10的生理功能與其兩種生化作用密切相關：一是其具有的抗氧化能力，二是其在電子傳遞鏈上的角色，傳遞電子與質子，促進生成ATP。輔酶Q10還原態(tài)的、異戊二烯單體全為反式的結構比氧化態(tài)、異戊二烯單體全為順式結構具有更高的活性和理化作用。目前輔酶Q10在醫(yī)學上是一種很好的臨床生化藥物，常用于肝病、心血管疾病、癌癥的綜合治療與提高機體的免疫力。在食品領域作為一種新型食品營養(yǎng)添加劑，具有增強體能與提高免疫力的作用。同時輔酶Q10對延緩衰老和提高機體免疫力有著不可代替的作用，被廣泛應用于女性化妝品領域[1]。

2 輔酶Q10的生產方法

輔酶Q10的生產方法一般分為直接提取法、化學合成法、微生物發(fā)酵法等[2]。直接提取法主要從大豆、煙葉或動物內臟中進行分離和提取。提取法制備工藝較簡單，但提取成本高，且受原料及季節(jié)等的限制，不適合于現(xiàn)代化工業(yè)大生產。化學合成法主要分為不以茄尼醇作為原料的全化學合成法、以茄尼醇作為原料的半化學合成法?；瘜W合成法合成過程反應復雜、步驟多、轉化效率低、往往還存在許多副產物，這些因素都影響了其產業(yè)化發(fā)展。微生物發(fā)酵法是目前生產輔酶Q10的最主要方法。該方法由于原料廉價豐富，產物分離過程相對簡單，產物為天然品，不存在化合物手性問題，生物活性好，易被人體吸收，且可以通過發(fā)酵罐實現(xiàn)規(guī)?；I(yè)化生產，因此成為最有發(fā)展?jié)摿Φ妮o酶Q10生產方法。

3 輔酶Q10主要產生菌及高產菌株選育

輔酶Q10產生菌大多為細菌[3]，主要包括莢膜紅細菌、類球紅細菌、渾球紅細菌、沼澤紅假單胞菌、深紅紅螺菌和根癌農桿菌等。通常微生物發(fā)酵產生輔酶Q10的產量在30～130mg/L，據(jù)估計要實現(xiàn)商業(yè)化生產，輔酶Q10的產量應該高于500mg/L[4]。在國際上，日本是最早開發(fā)輔酶Ｑ10的國家，報道的球紅假單胞菌菌種生產水平達到770mg/L，收率達到70%以上，近幾年來，韓國在輔酶Ｑ10領域的研究也較為深入，其中根癌農桿菌KCCM10413的發(fā)酵水平達到626mg/L。國內上世紀90年代開始發(fā)酵法輔酶Q10的研究，表1列出國內研究單位輔酶Q10主要菌種，目前我國多家企業(yè)參與開發(fā)和發(fā)酵生產，其中廈門金達威集團、神舟生物已經投入工業(yè)化生產，所生產的輔酶Q10產品已經占據(jù)市場相當大的份額。

輔酶Q10高產菌株主要選育方法是采用傳統(tǒng)誘變選育輔酶Q10高產菌株，即將輔酶Q10的出發(fā)菌株經過一些誘變因子處理，如紫外誘變和NTG誘變，然后選育出營養(yǎng)缺陷型、抗反饋調節(jié)、抗葡萄糖分解阻遏的輔酶Q10高產菌株，表2列出國內成功選育的典例。近年也有采用基因工程育種與基因改組育種選育輔酶Q10高產菌株的相關報道[5-10]。

表1 國內開發(fā)輔酶Q10主要菌種

4 發(fā)酵培養(yǎng)基對輔酶Q10發(fā)酵的影響

4.1 碳、氮源對輔酶Q10發(fā)酵的影響

碳、氮源是微生物生長所需的重要營養(yǎng)因子，其中碳源是構成微生物細胞的骨架，為各種代謝提供能量；氮源提供微生物其它細胞結構的原材料。不同種類的蛋白質，其氨基酸的種類和含量具有一定的差異，培養(yǎng)基中部分氨基酸的濃度對其產物具有很大的影響，不同的微生物對碳、氮源的需求也不一樣。吳祖芳等考察了玉米漿、蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、糖蜜、蔗糖等幾種碳氮源和添加物以及流加發(fā)酵生長因子對放射型根瘤菌WSH2601（WSH2601）的細胞生長和輔酶Q10合成的影響[5]，實驗證明，最佳碳源為蔗糖，其次為糖蜜和葡萄糖；最佳氮源為玉米漿，其次為酵母膏，蛋白胨較差些。魏寶東等考察蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉對合成輔酶Q10的影響，結果表明最佳碳源為蔗糖，輔酶Q10產量為40.54mg/L，其次是葡萄糖。

4.2 生長因子和無機鹽對輔酶Q10發(fā)酵的影響

不同的生長因子對產物形成的影響具有一定的差異，如氨基酸、核酸堿基、維生素和天然氮化物在不同菌種中影響大小不同。潘春梅等[9]研究了幾種促進劑對放射型根瘤菌細胞生長及其輔酶Q10發(fā)酵的影響，結果表明：VB1對輔酶Q10的合成起明顯促進作用，當VB1添加量為10mg/L，乙酸鈉2g/L，花生油2g/L時，輔酶Q10產量達到50.7mg/L，比對照組分別提高33%。

一些金屬離子也能提高輔酶Q10的產量，袁靜等[10]研究表明適當濃度的Co2+、Fe2+、Mg2+等對輔酶Q10的合成具有一定的促進作用，Mg2+是輔酶Q10合成過程中的關鍵酶的輔基，F(xiàn)e2+起著電子傳遞的作用[10]。

5 發(fā)酵條件對輔酶Q10發(fā)酵的影響

5.1 溶氧對輔酶Q10發(fā)酵的影響

據(jù)文獻報道，通氣量是輔酶Q10發(fā)酵的一個重要影響因素，大多數(shù)的輔酶Q10發(fā)酵都為有氧發(fā)酵。對于某些菌體而言，較高的溶氧有利于輔酶Q10的合成，有些菌種低氧有利于輔酶Q10的合成。Hajime Yoshidat研究表明，低通氣量時可以促進和輔酶Q10的合成，高通氣量抑制了輔酶Q10的合成[11]。吳祖芳等[8]研究表明，發(fā)酵的不同時期溶氧對輔酶Q10的合成具有不同的影響，前期菌體的快速生長，溶氧應高些，在細胞穩(wěn)定期后，應控制為低氧，有利于輔酶Q10的合成。

5.2 pH對輔酶Q10發(fā)酵的影響

pH是微生物發(fā)酵代謝活動中一個重要的綜合指標，是發(fā)酵中一個重要的參考參數(shù)。pH對菌體的生長和代謝產物的積累有很大的影響。在生產中通過檢測和控制適當?shù)纳apH，可以促進菌體合成輔酶Q10。在實際生產發(fā)酵中調節(jié)pH具有以下幾個手段：（1）用碳酸鈣作為緩沖劑；（2）用氨水來調節(jié)pH；（3）控制補糖的速率。許激揚等[12]研究表明，酵母菌SY-3在pH=4時輔酶Q10較高。葉博等[13]研究表明黃色隱球酵母菌在pH=6.5時輔酶Q10產量最大。

5.3 發(fā)酵溫度對輔酶Q10發(fā)酵的影響

溫度對輔酶Q10的積累具有一定的影響，主要體現(xiàn)在兩個方面：（1）溫度既影響菌體的生長，同時也對輔酶Q10的生物合成具有影響，比如影響代謝途徑的方向。（2）溫度影響發(fā)酵液的粘稠度，影響溶解氧的傳遞和基質的溶解。陳亮等[14]研究表明，粉紅擲孢酵母最適合菌體生長和發(fā)酵溫度為28～32℃，當溫度在30℃時，輔酶Q10含量達到最高。姜劍文等[15]研究表明，根癌農桿菌最適發(fā)酵溫度為32℃。

6 展望

隨著輔酶Q10的需求量不斷攀升，利用微生物發(fā)酵法生產輔酶Q10顯得愈發(fā)重要。為了進一步降低生產成本，一方面要加快高產菌株的選育進程，采用分子生物學技術的新型育種手段，應用代謝工程的方法選育高產菌株，構建工程菌株。另一方面，要進一步深入研究輔酶Q10發(fā)酵過程生化研究，優(yōu)化發(fā)酵過程各個參數(shù)的工藝控制，同時建立自動化控制模式，從而實現(xiàn)工程菌的高效表達。

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* 福建省教育廳資助項目，編號JA10067。