香菇多糖增強(qiáng)5－FU抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖機(jī)制研究

袁昌勁，孔慶志，盧宏達(dá)，孔雙喜

（1.武漢市中心醫(yī)院 腫瘤科，湖北 武漢430014；2.華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院 腫瘤科）

香菇多糖主要為甘露糖甘肽，其余為多種糖分和各種氨基酸等，對光和熱穩(wěn)定，不溶于甲醇、乙醇和丙酮等有機(jī)溶劑［1］，聯(lián)合抗腫瘤藥物對胃癌［2］、結(jié)腸癌［3］、肺癌［4］等腫瘤具有良好的療效，顯著延長腫瘤患者存活時間。目前對香菇多糖的抗腫瘤機(jī)制仍然不清楚，一般認(rèn)為和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。香菇多糖是典型的T細(xì)胞激活劑，體內(nèi)外均能促進(jìn)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（CTL）的產(chǎn)生，提高CTL細(xì)胞殺傷力，增強(qiáng)正常或免疫功能低下小鼠的遲發(fā)型超敏反應(yīng)，提高抗體依賴性細(xì)胞毒作用，同時能結(jié)合到人單核細(xì)胞上激活內(nèi)源性信號傳導(dǎo)通路［5，6］。本文應(yīng)用香菇多糖及5－FU處理SW480結(jié)腸癌細(xì)胞，探討其對細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并研究其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

SW480結(jié)腸癌細(xì)胞購于美國ATCC，RPMI－1640、雙抗和FBS購于Gibco公司，MTT試劑購于Sigma公司，RNA 提取和 RT－PCR試劑盒購于Takara公司，引物由上海生工公司合成，香菇多糖采用南京康海藥業(yè)有限公司的香菇多糖凍干粉劑，5－FU購于Sigma公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理

SW480結(jié)腸癌細(xì)胞完全培養(yǎng)基為10%FBS、89%RPMI－1640和1%雙抗，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱，實(shí)驗(yàn)時取對數(shù)生長期細(xì)胞。香菇多糖凍干粉劑用生理鹽水配制成5μmol／ml，5－FU用生理鹽水配制成500mg／L存儲液，根據(jù)王峻［7］和Harada［8］等研究，使用時加入完全培養(yǎng)基配制如下濃度工作液①Len組：Lentinan終濃度0.05 μmol／ml；②FU組：5－FU終濃度100mg／L；③L＋F組：Lentinan終濃度0.05μmol／ml和100mg／L 5－FU終濃度。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖

每孔1000個細(xì)胞接種于96孔板，每孔200μl，加入工作液處理24h后，PBS洗滌3次更換新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)。每天MTT法檢測一孔，每孔加入5 mg／ml MTT溶液20μl，37℃孵育4h后棄去，加入DMSO 50μl，振蕩15min充分溶解結(jié)晶，酶標(biāo)檢測儀上測定波長為490nm下的吸光值（A值），每孔細(xì)胞吸光度＝測得值－空白對照孔值。以吸光值為縱坐標(biāo)，以時間（天）為橫坐標(biāo)，繪制Len組、FU組、L＋F組和正常未處理組SW480結(jié)腸癌細(xì)胞增殖曲線。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡

藥物處理24h后收集細(xì)胞并離心，細(xì)胞沉淀用PBS洗滌，加入標(biāo)記有異硫氰酸熒光素的連接素Annexin V－FITC和碘化丙錠，避光孵育15min后檢測細(xì)胞凋亡，另制成200μl細(xì)胞懸液，加入70%的冰乙醇5ml－20℃固定24h以上，加入RNase A 200μl，37℃溫育30min，加入碘化丙啶至終濃度50mg／L，檢測細(xì)胞周期。增殖指數(shù)（PI）＝（S＋G2／M）／（G0／G1＋S＋G2／M）。

1.5 RT－PCR檢測多藥耐藥基因 MDR1、MRP1和LRP表達(dá)

按照RNA提取試劑盒說明提取細(xì)胞總RNA，用β－actin作為內(nèi)參照進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增，引物序列參見表1。PCR反應(yīng)體系為25μl，反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性5min，94℃變性45s，表1基因?qū)?yīng)退火溫度退火30s，72℃延伸30s，共35個循環(huán)，最后一輪72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)20g／L瓊脂糖凝膠電泳后檢測。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS12.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析。采用t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SW480結(jié)腸癌細(xì)胞增殖

正常對照組SW480結(jié)腸癌細(xì)胞表現(xiàn)為對數(shù)增殖狀態(tài)，單獨(dú)5－FU處理后，增殖速度較對照組顯著降低，增殖速度降低，細(xì)胞增殖受到抑制；單獨(dú)香菇多糖對細(xì)胞增殖無明顯影響，聯(lián)合5－FU作用后的細(xì)胞增殖速度顯著降低（圖1）。

表1 MDR1、MRP1和LRP基因RT－PCR反應(yīng)序列和退火溫度

2.2 細(xì)胞形態(tài)與凋亡

鏡下觀察，F(xiàn)U組SW480結(jié)腸癌細(xì)胞體積縮小、死亡，細(xì)胞密度較對照組降低；Len組結(jié)腸癌細(xì)胞無明顯細(xì)胞體積縮小和死亡，細(xì)胞密度和對照組無明顯區(qū)別；香菇多糖聯(lián)合5－FU處理后，死亡細(xì)胞增加，細(xì)胞密度較對照組顯著降低，明顯低于FU組。Len組與對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），F(xiàn)U組G0／G1期細(xì)胞明顯增加，S期細(xì)胞降低，PI明顯降低，細(xì)胞凋亡率顯著提高（P＜0.05），L＋F組與FU組和對照組相比，細(xì)胞凋亡率顯著增加，PI降低，細(xì)胞停滯于G0／G1期，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

圖1 SW480結(jié)腸癌細(xì)胞增殖曲線

表2 SW480結(jié)腸癌細(xì)胞細(xì)胞周期與凋亡（±s）

表2 SW480結(jié)腸癌細(xì)胞細(xì)胞周期與凋亡（±s）

與對照組相比，＊P＜0.05，＃P＞0.05；a、b和c之間，P＜0.05

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2.3 RT－PCR檢測耐藥基因表達(dá)

正常對照組SW480結(jié)腸癌細(xì)胞均可檢測到MDR1、MRP1和LRP基因mRNA表達(dá)，加入5－FU藥物處理后，MDR1基因表達(dá)增加，MRP1和LRP基因表達(dá)無明顯變化。香菇多糖能顯著降低MDR1和MRP1基因表達(dá)，而對LRP表達(dá)無影響。香菇多糖聯(lián)合5－FU抑制MDR1和MRP1基因表達(dá)，表達(dá)呈缺失狀態(tài)，而對LRP基因表達(dá)無影響（圖2、圖3和圖4）。

3 討論

圖2 MDR1基因mRNA表達(dá)

圖3 MRP1基因mRNA表達(dá)

圖4 LRP基因mRNA表達(dá)

接受化療的患者在初次或再次接受化療時可能出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，藥物敏感度低于正常人。目前認(rèn)為腫瘤細(xì)胞的耐藥主要和誘導(dǎo)表達(dá)多藥耐藥基因相關(guān)，多藥耐藥基因主要包括MDR1、MRP1和LRP［9］。MDR1基因編碼產(chǎn)物P－糖蛋白位于細(xì)胞膜，由兩個完全相同的單體結(jié)構(gòu)構(gòu)成每個單體有一個ATP結(jié)合位點(diǎn)，跨膜區(qū)域構(gòu)成藥物通道盒式結(jié)構(gòu)，ATP結(jié)合位點(diǎn)與能量供應(yīng)有關(guān)，P－糖蛋白利用ATP水解功能將抗腫瘤藥物泵出胞膜外［10］。MRP1基因編碼的多藥耐藥相關(guān)蛋白1屬于非P－gp跨膜糖蛋白ATP依賴泵，能將帶負(fù)電荷的藥物分子逆濃度泵出到胞外，減少胞內(nèi)藥物濃度，還可改變細(xì)胞漿及細(xì)胞器的pH值，使藥物到達(dá)作用部位的靶位點(diǎn)時濃度減少，避免藥物與靶點(diǎn)結(jié)合，直接參與腫瘤的轉(zhuǎn)移［11］。LRP廣泛分布于正常組織，使順鉑不能通過核孔進(jìn)入細(xì)胞核，阻止以胞核為效應(yīng)點(diǎn)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)到胞漿中；將進(jìn)入胞漿的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)到運(yùn)輸囊泡中，起隔絕藥物作用，最終通過胞吐的方式到細(xì)胞外，主要介導(dǎo)烷化劑的耐藥［12］。目前研究表明，人工抑制多藥耐藥基因表達(dá)能顯著改善耐藥現(xiàn)象，提高化療藥物的療效。

5－FU為細(xì)胞周期特異性藥，主要抑制S期細(xì)胞。在體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)?－氟－2－脫氧尿嘧啶核苷酸，抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，阻斷脫氧尿嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)變?yōu)槊撗跣叵汆奏ず塑账岫种艱NA的生物合成。研究表明，梯度5－FU濃度刺激導(dǎo)致細(xì)胞多藥耐藥基因表達(dá)增加，利用該機(jī)制已經(jīng)成功制備5－FU耐藥細(xì)胞株［13，14］。本研究表明 5－FU 接觸 SW480結(jié)腸癌細(xì)胞后，MDR1表達(dá)增加，該現(xiàn)象與Theile等［15］研究一致。香菇多糖能顯著降低 MDR1和MRP1基因表達(dá)，而對LRP表達(dá)無影響，其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

5－FU為S周期特異性抑制劑，抑制細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂器，本研究也證實(shí)該現(xiàn)象。5－FU聯(lián)合香菇多糖后，細(xì)胞仍然表現(xiàn)為停滯于G0／G1期特點(diǎn)，表明香菇多糖并沒有改變5－FU作用特點(diǎn)，但細(xì)胞增殖速度明顯降低，凋亡增加，我們推測是香菇多糖增加了SW480結(jié)腸癌細(xì)胞對5－FU的敏感性。香菇多糖能顯著降低多藥耐藥基因表達(dá)，正是該機(jī)制導(dǎo)致SW480對5－FU誘導(dǎo)耐藥作用減少，從而增加了細(xì)胞對5－FU的敏感度，但兩者之間是否存在因果關(guān)系，有待進(jìn)一步研究。

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