聯(lián)合檢測(cè)炎癥因子IL－6、TNF－α和 MCP－1對(duì)冠心病臨床診斷價(jià)值

黃 山，張 程，陳 艷，令狐穎，許 健，劉志琴

（1.貴州省人民醫(yī)院a.臨床檢驗(yàn)中心；b.心內(nèi)科，貴州 貴陽(yáng)550002；2.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院09級(jí)碩士研究生）

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病指冠狀動(dòng)脈粥樣硬化使血管腔狹窄或阻塞，或（和）因冠狀動(dòng)脈功能性改變（痙攣）導(dǎo)致心肌缺血缺氧或壞死而引起的心臟病。“炎癥假說(shuō)”是動(dòng)脈粥樣硬化主要發(fā)病機(jī)制［1］，白細(xì)胞介素－6（IL－6）、腫瘤壞死因子－α（TNF－α）和單核細(xì)胞趨化因子－1（MCP－1）等炎癥性因子在其過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。目前流式細(xì)胞儀在臨床上的應(yīng)用不斷擴(kuò)大，鑒于此本研究應(yīng)用熒光微球編碼技術(shù)，建立了流式微球分析技術(shù)（cytometric bead assay，CBA）聯(lián)合檢測(cè)IL－6、TNF－α和 MCP－1的方法，對(duì)冠心病患者血清進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)冠心病的診斷具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

血清標(biāo)本采自2010年8月－2011年5月貴州省人民醫(yī)院心內(nèi)科住院病人和健康體檢者。清晨空腹采血，3 000rpm×10min分離血清，－70℃保存待檢。正常對(duì)照組收集50例，男30例，女20例，年齡35－55歲，平均年齡43±2.26歲，均來(lái)自各項(xiàng)體檢指標(biāo)正常的健康人群；冠心病組收集150例，男85例，女65例，年齡35－81歲，平均年齡52±1.35歲，穩(wěn)定性心絞痛組、不穩(wěn)定性心絞痛組和急性心肌梗死組血清標(biāo)本各50例，經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影術(shù)等檢查確診。

1.2 主要試劑和儀器

BD Array流式細(xì)胞儀，酶標(biāo)儀和洗板機(jī)（均為北京 普 朗 公 司 產(chǎn) 品），人 IL－6、TNF－α 和 MCP－1 ELISA檢測(cè)試劑盒（R＆D公司產(chǎn)品，批號(hào)分別為CK－E10140H、CK－E10110H 和CK－E10136H）等。

1.3 方法

采用SPSS13.0軟件設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)表和進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果方差分析，對(duì)IL－6、TNF－α和 MCP－1 3種鼠抗人單克隆抗體聯(lián)接羧基化微球的最佳聯(lián)接量、PE標(biāo)記的親和素的稀釋倍數(shù)和洗滌次數(shù)以及孵育時(shí)間、生物素標(biāo)記抗體的稀釋倍數(shù)和洗滌次數(shù)及孵育時(shí)間等驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化選擇。以羧基化微球標(biāo)記的不同的熒光素為定性基礎(chǔ)，操作遵循儀器的說(shuō)明，試驗(yàn)條件選擇優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)參數(shù)，建立了流式微球聯(lián)合檢測(cè)IL－6、TNF－α和 MCP－1的分析技術(shù)，即可對(duì)待檢血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)用IL－6、TNF－α和MCP－1ELISA法檢測(cè)試劑盒對(duì)血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0軟件設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)表和進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果方差分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用配對(duì)資料t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 健康對(duì)照組及冠心病組血清中IL－6、TNF－α、MCP－1檢測(cè)結(jié)果 運(yùn)用自建CBA方法對(duì)健康對(duì)照組及冠心病不同疾病組血清中IL－6、TNF－α、MCP－1進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1。通過(guò)統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)健康對(duì)照組、穩(wěn)定性心絞痛組、不穩(wěn)定性心絞痛組、急性心肌梗死組血清中IL－6、TNF－α、MCP－1水平進(jìn)行t檢驗(yàn)，4組兩兩比較其P＜0.01，說(shuō)明各組血清中IL－6、TNF－α、MCP－1水平均具有顯著性差異。

表1 CBA聯(lián)合檢測(cè)各組血清標(biāo)本炎癥因子結(jié)果（pg／ml）

2.2 建CBA技術(shù)與ELISA法檢測(cè)結(jié)果比較 20

份血清標(biāo)本中IL－6、TNF－α、MCP－1水平采用 CBA方法與ELISA法試劑盒測(cè)定，以±s（pg／mL）表示，結(jié)果見(jiàn)表2。對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)，采用配對(duì)t檢驗(yàn)，兩種方法檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著差異。

表2 自建CBA技術(shù)與ELISA法檢測(cè)結(jié)果比較

2.3 自 建 CBA 技 術(shù) 聯(lián) 合 檢 測(cè) IL－6、TNF－α 和MCP－1對(duì)冠心病診斷效能評(píng)價(jià) 采用SPSS13.0軟件，得出CBA技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)IL－6、TNF－α和 MCP－1的ROC曲線，ROC曲線下面積（AUC）分別為0.940、0.930和0.867，其 P值均小于0.01，血清中IL－6、TNF－α和 MCP－1水平用于診斷冠心病有顯著意義。根據(jù)ROC曲線，選擇圖中最靠近左上方的點(diǎn)，根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果在可能切點(diǎn)的敏感性和特異性計(jì)算敏感性＋特異性，最高值為臨界值，從SPSS輸出的表中查得IL－6、TNF－α和 MCP－1診斷冠心病的cut－off值分別為5.81pg／ml、7.55pg／ml和61.98 pg／ml。依 據(jù) 選 定 的 cut－off 值，IL－6、TNF－α 和MCP－1的診斷靈敏度分別為89.3%、90.7%和84.0%；特異性分別為88.0%、78.0%和82.0%；陽(yáng)性似然比分別為7.44、4.12和4.67；陰性似然比為0.12、0.12和0.20，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值分別為95.71%、92.52%和93.33%；陰性預(yù)測(cè)值為73.33%、73.58%和63.08%，Youden指數(shù)分別為0.773、0.687和0.660。

2.4 IL－6、TNF－α和 MCP－1 3種因子對(duì)冠心病的聯(lián)合診斷效能評(píng)價(jià) 按3種因子的cut－off值，統(tǒng)計(jì)健康對(duì)照組和冠心病組血清中IL－6、TNF－α、MCP－1陽(yáng)性的例數(shù)，以評(píng)價(jià)單項(xiàng)指標(biāo)和聯(lián)合應(yīng)用對(duì)冠心病中的診斷效能，結(jié)果見(jiàn)表3。根據(jù)表3數(shù)據(jù)，得出血清中IL－6、TNF－α和 MCP－1 3項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用診斷靈敏度為94%，特異性為72%。對(duì)單項(xiàng)指標(biāo)和3項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用的靈敏度和特異性進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，各單項(xiàng)指標(biāo)之間的靈敏度和特異性無(wú)顯著性差異，3項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用的靈敏度優(yōu)于各單項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)的靈敏度，而3項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用的特異性與單項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)的特異性無(wú)顯著性差異。作為一種診斷冠心病的初篩方法，流式微球聯(lián)合檢測(cè)法IL－6、TNF－α和MCP－1具有較高的靈敏度，可以對(duì)冠心病進(jìn)行早期診斷。

表3 3種因子單項(xiàng)和聯(lián)合應(yīng)用對(duì)冠心病診斷陽(yáng)性率的比較（例，%）

3 討論

冠心病（coronary artery heart disease，CHD）已成為危害我國(guó)人民群眾生命和健康的重大疾病。隨著醫(yī)學(xué)研究的不斷深入，一些化學(xué)因子和細(xì)胞因子不斷被檢出，認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化的表現(xiàn)符合炎癥表現(xiàn)的普遍規(guī)律，許多炎癥性因子參與了動(dòng)脈粥樣硬化的形成過(guò)程。白細(xì)胞介素－6，主要源自活化的單核／巨噬細(xì)胞，可誘導(dǎo)急性期炎性反應(yīng)的產(chǎn)生，IL－6的高低與炎癥的反應(yīng)程度密切相關(guān)。研究表明冠心病組與對(duì)照組之間IL－6差異有顯著意義，其機(jī)制可能為：①IL－6刺激肝臟產(chǎn)生纖溶酶原激活物抑制劑（PAI），PAI和纖溶酶原激活物（tPA）結(jié)合并使其失去活性，導(dǎo)致纖溶功能低下，促進(jìn)血小板聚集和血栓形成；②促使心肌細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞間黏附因子－1（ICAM－1）增多，加快中性粒細(xì)胞（PMN）與心肌細(xì)胞的黏附過(guò)程，從而釋放氧自由基，加重心肌細(xì)胞損害；③通過(guò)一氧化氮（NO）介導(dǎo)，使心肌細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷（cGMP）濃度升高，Ca2＋濃度下降，發(fā)揮負(fù)性肌力作用［2］。TNF－α在正常心肌組織中表達(dá)水平較低或不表達(dá)，心肌梗死可促使心肌組織合成TNF－a。一方面，TNF－α通過(guò)誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）表達(dá)使維持正常心肌細(xì)胞排列的膠原網(wǎng)降解，最終導(dǎo)致心室腔擴(kuò)大。另一方面，TNF－α的細(xì)胞毒效應(yīng)構(gòu)成心室重構(gòu)的特征性改變和心功能不全不斷加重［3］。MCP－1作為一種特異性單核細(xì)胞趨化因子，促進(jìn)單核細(xì)胞向受損的內(nèi)皮細(xì)胞趨化、黏附，然后進(jìn)一步遷入血管內(nèi)膜下，并活化為巨噬細(xì)胞，不斷吞噬類脂質(zhì)，形成泡沫細(xì)胞及脂質(zhì)池，成為AS的最早病變脂質(zhì)條［4］。由于單核細(xì)胞的遷移是動(dòng)脈粥樣硬化形成的早期病理表現(xiàn)，因此血漿MCP－1水平是冠心病早期病理變化和斑塊活動(dòng)的標(biāo)志物，為臨床早期預(yù)測(cè)病情進(jìn)展提供了依據(jù)［5］。

在炎癥性標(biāo)志物的檢驗(yàn)中，方法較多，目前主要有生物活性檢測(cè)法、免疫學(xué)檢測(cè)法、分子生物學(xué)檢測(cè)法［6，7］。近年來(lái)，流式細(xì)胞分析儀在臨床不斷普及，拓展流式細(xì)胞分析技術(shù)，延伸流式細(xì)胞儀應(yīng)用領(lǐng)域，有著非常重要的意義。為此，本文建立流式微球分析技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)IL－6、TNF－α和 MCP－1的方法。通過(guò)對(duì)流式微球聯(lián)合檢測(cè)法和ELISA法檢測(cè)血清中的IL－6、TNF－α、MCP－1的結(jié)果進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，P值均大0.05，說(shuō)明兩種檢測(cè)方法無(wú)顯著差異。但有著ELISA無(wú)法比擬的優(yōu)越性：通量大；標(biāo)本利用率高；特異性強(qiáng)；敏感度高，線性范圍寬，重復(fù)性好；液相反應(yīng) ；節(jié)約人力資源，操作簡(jiǎn)便、快捷、耗時(shí)短。根據(jù)IL－6、TNF－α、MCP－1檢測(cè)的 ROC曲線，其面積分別為0.940、0.930和0.867，在 AUC＞0.5的情況下，AUC越接近于1，說(shuō)明診斷效果越好，并且各因子的診斷靈敏度、特異性、陽(yáng)性似然比、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和Youden指數(shù)等指標(biāo)均較為滿意，3項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用具有較高的靈敏度，可用于對(duì)冠心病進(jìn)行早期診斷，值得在臨床上推廣使用。

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