低分子量肝素聯合吉西他濱對乳腺癌細胞侵襲和遷移能力的影響

趙素容，劉 浩，吳成柱，王 秀，梁 穎，陳 超，蔣志文

(蚌埠醫學院藥學系，安徽省生化藥物工程技術研究中心，安徽蚌埠 233030)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，其發病率不斷上升，并且發病年齡趨于年輕化。目前，含蒽環類和紫杉類藥物的化療方案是治療乳腺癌的首選方案，盡管療效顯著，但易發生耐藥，一旦出現耐藥，臨床治療就相當困難。吉西他濱(gemcitabine，GEM)是一種嘧啶類抗代謝藥，主要殺傷S期細胞，也可以阻止細胞由G1期向S期進展。GEM對蒽環類和紫杉類藥物耐藥的乳腺癌有較高的療效，且耐受性較好［1］。是目前治療轉移性乳腺癌、晚期乳腺癌和復發性乳腺癌的主要藥物之一。研究表明，肝素及其類似物具有延長腫瘤患者生存期，抑制腫瘤細胞增殖、血管生成、侵襲、遷移以及增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性等生物活性，其抗腫瘤作用日益受到重視［2－5］。本實驗研究低分子量肝素(low molecular weight heparin，LMWH)對GEM抗腫瘤作用的影響，并分析可能的作用機制，以期為乳腺癌的治療提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1細胞株人乳腺癌細胞株 MDA-MB-231、MDA-MB-435由蚌埠醫學院生化藥理研究室保存。培養條件:含10%新生牛血清的DMEM高糖培養基，37℃，5%CO2飽和濕度培養箱。

1.2主要試劑DMEM高糖培養基、胰蛋白酶、新生牛血清:Gibco公司;低分子量肝素鈉注射液(克賽，平均分子質量為3 500～5 500 u):Sanofi-Aventis公司;注射用鹽酸吉西他濱:江蘇豪森藥業股份有限公司;Transwell小室:Costar公司;Matrigel基質蛋白:BD公司;MMP-9抗體、β-actin抗體:武漢博士德生物工程有限公司;山羊抗兔IgG:中杉金橋生物技術有限公司;人乙酰肝素酶ELISA試劑盒:R＆D公司。

1.3MTT法檢測細胞存活率取對數生長期細胞，0.25%胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，并調整細胞密度為3×107·L－1，接種于96孔板中，每孔200 μl，于5%CO2飽和濕度37℃培養箱中培養24 h，不同濃度 LMWH(6.25 ×104、12.5 ×104、25 ×104、50×104、100 ×104IU·L－1)、GEM(0.625、1.25、2.5、5、10 mg·L－1)以及 60 ×104IU·L－1LMWH 聯合GEM(0.625、1.25、2.5、5、10 mg·L－1)處理，同時設陰性對照組和空白對照組，每個處理3個復孔，繼續培養 24、48、72 h 后每孔加入 10 μl濃度為 5 g·L－1的MTT溶液繼續孵育4 h，棄去培養液，每孔加入150 μl DMSO，37℃孵育30 min，微量振蕩器振蕩10 min使結晶物充分溶解，用酶標儀在570 nm波長下檢測每孔的吸光度(D)值，計算細胞存活率:細胞存活率/%=實驗組D570nm/對照組D570nm×100%，繪制劑量效應曲線，采用Logit法計算半數抑制濃度(IC50)。以上實驗重復3次。

1.4細胞劃痕實驗將對數生長期細胞制成單細胞懸液接種于24孔細胞培養板，每孔3×105個細胞，培養24 h，用無菌槍頭沿孔中心劃出一道“傷痕”，PBS沖洗干凈，每孔加入含2%新生牛血清的DMEM高糖培養基500 μl。實驗分為對照組和藥物處理組(30 ×104IU·L－1LMWH 組、2.5 mg·L－1GEM 組、30 ×104IU·L－1LMWH 聯合2.5 mg·L－1GEM組)。處理24 h后觀察細胞向中間遷移的情況并拍照。

1.5Transwell細胞遷移與侵襲實驗細胞遷移實驗:取對數生長期細胞，消化離心，用含30×104IU·L－1LMWH、2.5 mg·L－1GEM、30 ×104IU·L－1LMWH聯合2.5 mg·L－1GEM的無血清培養基稀釋細胞至5×108·L－1，每個 Transwell小室中加入100 μl，下室每孔加入含5%胎牛血清的DMEM高糖培養基600 μl，培養24 h后取出小室，用棉簽擦去小室上層未遷移的細胞，4%多聚甲醛室溫固定15 min，0.1%結晶紫染色15 min，各取5個400×視野顯微鏡下觀察拍照。遷移抑制率/%=(1－實驗組遷移細胞數/對照組遷移細胞數)×100%。

細胞侵襲實驗:每個Transwell小室的聚碳酸酯微孔膜鋪50 μl Matrigel基質蛋白，藥物處理36 h，其余操作同細胞遷移實驗。侵襲抑制率/%=(1－實驗組侵襲細胞數/對照組侵襲細胞數)×100%。

1.6Western blot檢測MMP-9的蛋白表達將對數生長期的細胞接種于6孔細胞培養板中，培養至90%融合，換液加入含60×104IU·L－1LMWH、5 mg·L－1GEM、60 ×104IU·L－1LMWH 聯合5 mg·L－1GEM的培養基繼續培養。處理24 h后消化收集細胞，用預冷PBS洗2次，每個處理加入70 μl預冷的蛋白裂解液［20 mmol·L－1Tris-HCl(pH 7.5)，150 mmol·L－1NaCl，1 mmol·L－1EDTA，1 mmol·L－1EGTA，1 mmol·L－1原礬酸鈉，1 mmol·L－1PMSF，體積分數為1%的Triton X-100，2.5 mmol·L－1焦磷酸鈉，40 mmol·L－1β-甘油磷酸，10 mg·L－1的亮肽素、抑肽酶和大豆胰蛋白酶抑制劑］，冰上裂解30 min，提取細胞總蛋白，BCA蛋白定量法測定各組蛋白濃度。每組取40 μg蛋白，10%SDS-PAGE 電泳(70 V，30 min;120 V，90 min);轉膜(50 V，120 min)至PVDF膜;5%脫脂牛奶室溫封閉2 h;一抗1∶200室溫孵育2 h;TPBS洗膜3次;二抗1∶2 000室溫孵育1 h;TPBS洗膜3次;ECL發光試劑盒顯影;Bio-Rad凝膠成像系統獲取圖像。

1.7ELISA法檢測乳腺癌細胞培養液中HPA的表達將對數生長期細胞制成單細胞懸液接種于96孔細胞培養板，每孔1×104個細胞，細胞充分貼壁后換液加入含60×104IU·L－1LMWH、5 mg·L－1GEM、60 ×104IU·L－1LMWH 聯合 5 mg·L－1GEM的培養基繼續培養，每個處理設3個復孔。處理24 h后收集上清，按試劑盒說明書進行檢測。結果以實驗組D450nm/對照組D450nm確定各組HPA的分泌情況。

Fig 1 Proliferation of breast cancer cells inhibited by GEM

1.8統計學方法實驗數據以±s表示，采用SPSS13.0軟件對數據進行單因素方差分析，各組間比較用雙側Dunnettt檢驗。

Fig 2 Inhibitory effect of LMWH，GEM，and LMWH combined with GEM on the migration of breast cancer cells by wound healing assay

2 結果

2.1細胞增殖情況MTT結果顯示，不同濃度GEM 處理 MDA-MB-231、MDA-MB-435 細胞 24、48、72 h，對細胞增殖具有抑制作用，且具有時間和濃度依賴性。MDA-MB-231細胞作用48 h的IC50為4.2 mg·L－1，MDA-MB-435 細胞作用48 h 的 IC50為 5.6 mg·L－1(Fig 1)。但 LMWH 在6.25×104～100×104IU·L－1濃度范圍內對 MDA-MB-231、MDA-MB-435細胞增殖的影響不明顯。與此同時，60×104IU·L－1LMWH 與不同濃度(0.625、1.25、2.5、5、10 mg·L－1)GEM合用結果顯示，LMWH亦不能增強GEM對MDA-MB-231、MDA-MB-435細胞增殖的抑制作用(數據未列出)。

2.2細胞遷移情況細胞劃痕實驗結果顯示，30×104IU·L－1LMWH、2.5 mg·L－1GEM 均可抑制MDA-MB-231、MDA-MB-435細胞的遷移，兩者合用后對細胞遷移能力的抑制作用更明顯(Fig 2)。Transwell細胞遷移實驗結果顯示，單用GEM時細胞的遷移抑制率分別為47.4%、52.9%;LMWH與GEM合用時細胞的遷移抑制率增加，分別為66.3%、76.5%，提示LMWH能增強GEM對乳腺癌細胞遷移的抑制作用(Fig 3)。

2.3細胞侵襲情況Transwell細胞侵襲實驗結果表明，LMWH、GEM以及LMWH與GEM合用均可明顯抑制MDA-MB-231、MDA-MB-435細胞對Matrigel基質蛋白的破壞作用，單用GEM時對MDA-MB-231、MDA-MB-435細胞的侵襲抑制率分別為37.8%、46.0%，LMWH與 GEM合用時分別為64.9%、71.4%，提示LMWH可增強GEM對乳腺癌細胞侵襲的抑制作用(Fig 4)。

2.4MMP-9的蛋白表達情況Western blot結果顯示，60 ×104IU·L－1LMWH、5 mg·L－1GEM 作用于MDA-MB-231、MDA-MB-435細胞24 h后，MMP-9蛋白表達下調，合用時下調更加明顯(Fig 5)。

2.5HPA的表達情況LMWH與GEM均可抑制MDA-MB-231、MDA-MB-435細胞HPA的分泌，合用時抑制作用更強，與對照組比較差異具有統計學意義(P＜0.05)(Fig 6)。

Fig 3 Inhibitory effect of LMWH，GEM，and LMWH combined with GEM on the migration of breast cancer cells by Transwell migration assay

Fig 4 Inhibitory effect of LMWH，GEM，and LMWH combined with GEM on the invasion of breast cancer cells by Transwell invasion assay

Fig 5 Expression of MMP-9 in breast cancer cells after exposure to LMWH，GEM，and LMWH combined with GEM for 24 h

3 討論

目前乳腺癌的治療以外科手術、化療、放療、內分泌治療、基因治療、中醫中藥治療等多種手段為主，但效果多不甚理想，尤其是單一藥物治療，存在嚴重的不良反應且容易產生耐藥，聯合不同作用機制的藥物，提高現有抗腫瘤藥物的療效、降低其毒副作用以及延緩耐藥性的產生，是腫瘤治療的一個重要策略［6］。本實驗觀察了LMWH聯合GEM對乳腺癌細胞增殖、侵襲、遷移以及MMP-9和HPA表達的影響。結果表明，LMWH具有增強GEM抑制乳腺癌細胞侵襲和遷移的作用，但對GEM的增殖抑制作用沒有明顯影響。

Fig 6 Expression of HPA in breast cancer cells after exposure to LMWH，GEM，and LMWH combined with GEM for 24 h

腫瘤細胞轉移包括腫瘤生長侵襲、細胞脫落進入循環流動、與脈管內皮或組織基質黏附、通過組織和間隙變形移動、降解破壞細胞間質和定植生長等主要過程。侵襲轉移是腫瘤惡性程度的重要生物學特性和影響腫瘤預后的主要因素，因此對侵襲轉移機制的深入研究對腫瘤治療方案的選擇和判斷預后具有重要的意義［7］。細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的降解是腫瘤侵襲轉移的關鍵步驟之一，主要依靠蛋白水解酶的作用。MMPs是一類鋅離子依賴性蛋白酶，通過降解ECM中的絕大部分組分促進腫瘤細胞侵襲轉移，其過表達與乳腺癌的高轉移潛能和不良預后相關［8］。MMPs也參與調節腫瘤細胞增殖、生長因子的釋放和腫瘤血管生成［9］。MMP-9是其中的關鍵分子之一，在乳腺癌患者中的高表達與腫瘤轉移的發生密切相關［10］。同時，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparin sulphate proteoglycans，HSPG)作為ECM的另一主要成分，其降解也是腫瘤細胞侵襲轉移的重要環節。HPA是目前已知體內唯一能夠降解HSPG的β-D-葡萄糖醛酸內切酶，可識別并降解HSPG的硫酸肝素(heparan sulfate，HS)側鏈，破壞由ECM組成的屏障結構，并釋放結合在HS上的生長因子(如 bFGF、PDGF、VEGF等)，從而刺激腫瘤細胞的生長和轉移［11］。HPA在正常組織中基本不表達，但在包括乳腺癌在內的許多人類惡性腫瘤中高表達，可望成為理想的抗腫瘤靶點［12］。本實驗結果顯示，LMWH能增強GEM下調MMP-9和HPA的表達，可能是其增強GEM抑制乳腺癌細胞侵襲和遷移的作用機制之一。

本實驗證明了LMWH具有增強GEM抑制MDA-MB-231、MDA-MB-435細胞侵襲和遷移的作用，二者聯合應用在抑制腫瘤侵襲轉移方面可能具有協同作用，具體的作用機制尚需進一步研究。

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