鹽酸關附甲素對大鼠血管舒縮功能的影響及其機制

陸家鳳，可 燕，蔣嘉燁，栗 源，李曉軍

(上海中醫藥大學教學實驗中心，上海 201203)

關白附為毛茛科植物黃花烏頭〔Aconitum coreanum(Levl.)Raip.〕的塊根，《名醫別錄》有記載“關白附辛溫發散，可通經脈”;既可作為溫里藥散寒止痛，又可祛風痰治療中風［1］。中風的原因之一是腦血管收縮或痙攣導致血壓升高、血管張力增加變脆，最終腦出血［2］，而溫里藥普遍有擴張心腦血管，增加血流量，改善微循環的功效［3］。關附甲素(guanfu base-A，GFA)是關白附中的主要活性單體化合物［4］，早在20世紀80年代就有學者就其對血壓的影響做過藥理研究，發現大鼠頸外靜脈注射GFA 30 mg·kg－1后血壓出現下降［5］。故本實驗旨在通過觀察GFA對大鼠離體胸主動脈血管張力的影響，探討其是否有擴血管功效，并分析可能的機制。

1 材料

1.1試劑和儀器關附甲素，批號:100665-200901，中國藥品生物制品檢定所;苯腎上腺素(phenylephrine，PE)，批號:P6126-5G，Sigma 公司;乙酰膽堿(ACh)，批號:A7000-5G，Sigma公司;毛喉素(forskolin，FSK)，批號:F6886，Sigma 公司;左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME)，批號:53-86-1，Adamas Reagent;亞甲藍(methylene blue)，批號:61-73-4，Adamas Reagent;吲哚美辛(indomethacin)，批號:51298-62-5，Adamas Reagent。Krebs-Henseleit(K-H)液(1 mmol·L－1:NaCl 118，KCl 4.7，KH2PO41.2，MgCl21.2，NaHCO325，CaCl22.5，Glucose 11，pH=7.4);無鈣液(1 mmol·L－1:NaCl 118，KCl 4.7，KH2PO41.2，MgCl21.2，NaHCO325，Glucose 11，pH=7.4):Powerlab八通道多功能生理記錄儀(AD Instruments公司)。

1.2動物SD大鼠，(250±20)g，♂，購于上海斯萊克實驗動物有限公司。

2 方法

2.1血管環的制備迅速取出胸主動脈置于4℃、含95%O2和5%CO2混合氣體預飽和的K-H液中，剝除周圍結締組織后制成3～4 mm的血管環。將血管環懸掛于4 ml K-H液的浴槽內，37℃恒溫，并持續通入95%O2+5%CO2的混合氣體。每個血管環給予2.0 g拉力，每15 min更換K-H液1次，平衡90 min。以60 mmol·L－1的KCl預收縮兩次，以誘發最大收縮度，用K-H液洗脫拉力穩定后，加入1 μmol·L－1的 PE 收縮，待拉力達坪值后，加入10－5mol·L－1ACh，若血管舒張達 80% 以上，可認為內皮完整;制備去內皮血管環時，可用棉簽輕拭血管環內表面，當加入10－5mol·L－1ACh后血管舒張度在20%以下為內皮被去除［6］。

2.2累積濃度的GFA對基礎狀態及KCl預收縮血管環的影響將內皮完整及去內皮的胸主動脈隨機分為:①內皮完整GFA組(GFA Endo+);② 內皮完整對照組(Control Endo+);③ 去內皮GFA組(GFA Endo－);④ 去內皮對照組(Control Endo－)。以不同累積濃度的GFA作用于基礎狀態及KCl(60 mmol·L－1)預刺激收縮的血管環，實驗組(n=6)采用累積加藥法，每2 min加GFA 1次，使浴槽中的 GFA 終濃度分別達 10－8、10－7、10－6、10－5、10－4mol·L－1，觀察 GFA 對兩種狀態下血管舒張度的影響，對照組(n=6)以蒸餾水代替GFA累積加入。

2.3累積濃度的GFA對PE預收縮的血管環的影響分組及加藥方法同“2.2”。實驗組(n=6)以不同累積濃度的GFA作用于PE(10－6mol·L－1)預收縮的血管環，觀察GFA對血管環的作用，對照組(n=6)以蒸餾水代替GFA累積加入。

2.4GFA對無鈣液預處理的去內皮血管環的作用實驗組(n=6)將血管去內皮后在無鈣液中穩定30 min，加 GFA(10－4mol·L－1)共育 15 min 后，再加PE(1 μmol·L－1)收縮血管，觀察 GFA 的作用，對照組(n=6)以K-H液代替GFA孵育去內皮血管環。

2.5GFA對L-NAME、亞甲藍和吲哚美辛預處理的PE收縮血管效應的影響實驗組(n=6)分別用L-NAME、亞甲藍和吲哚美辛(濃度均為0.1 mmol·L－1)孵育內皮完整的血管環20 min，以PE預收縮，觀察累積濃度GFA的血管舒張作用;對照組(n=6)以蒸餾水替代GFA累積加入。

2.6統計學處理結果以±s表示，應用SPSS 11.0軟件統計分析，兩組間比較采用t檢驗。

3 結果

3.1累積濃度的GFA對基礎狀態及KCl預收縮血管環的影響見Fig 1。累積濃度的GFA(10－8～10－4mol·L－1)對基礎狀態和KCl預收縮的內皮完整及去內皮的離體動脈環均無明顯影響(P＞0.05)。

3.2累積濃度的GFA對PE預收縮血管環的影響見 Fig 2。累積濃度的 GFA(10－8～ 10－4mol·L－1)對 PE(10－6mol·L－1)預收縮的內皮完整的胸主動脈有濃度依賴性舒張作用，最大舒張率可達33.05%;各濃度的GFA對去內皮的胸主動脈無舒張作用，與PE預收縮最大時的張力相比，差異無顯著性(P＞0.05)。

Fig 1 Effect of GFA on vasomotor function of aortic rings in basis tension(A)and precontracted by KCl(B)

Fig 2 Effect of GFA on vasomotor function of aortic rings precontracted by PE

3.3L-NAME、亞甲藍和吲哚美辛對GFA舒張血管作用的影響見Fig 3。與對照組相比，分別加入L-NAME、亞甲藍和吲哚美辛處理后GFA對PE預收縮的血管產生舒張作用明顯減弱。其中L-NAME組、吲哚美辛組與GFA組比較在10－7～10－4mol·L－1時差異有顯著性(P＜ 0.01)，而在 10－8mol·L－1時與GFA比較差異無顯著性(P＞0.05);亞甲藍組則在 GFA 10－8～10－4mol·L－1時差異均有顯著性(P＜0.01)。

Fig 3 Effect of GFA on vasomotor function of aortic rings after incubated with L-NAME，methylene blue or indomethacin

3.4 GFA對無鈣液預處理的去內皮血管環的影響

見 Fig 4。GFA(10－4mol·L－1)及無鈣液預處理后，血管對PE的收縮反應明顯降低(P＜0.01)。

Fig 4 Effect of GFA on endothelium-denuded rings preincubated with Ca2+free medium

4 討論

血管平滑肌和內皮細胞的形態及功能正常是形成健康血管的基礎。非內皮依賴性途徑下的血管平滑肌的舒縮主要與細胞外鈣離子的內流和內鈣離子的釋放從而使細胞內鈣離子濃度增加有關［7］。雖然KCl和PE均通過增加細胞內游離鈣濃度而使血管收縮，但機制卻不相同。KCl主要通過開放電壓門控鈣離子通道，使細胞外鈣內流引起血管平滑肌細胞超極化，從而使血管收縮［8］。而PE通過作用于受體操作性鈣通道(ROC)和通過激活磷脂酶C，后者產生甘油二酯(DG)和三磷酸肌醇(IP3)［9］，它們共同作用于鈣通道使肌漿網內Ca2+釋放［10］，而使血管平滑肌收縮。研究結果顯示，GFA可以劑量依賴性地抑制PE誘導的內皮完整的血管收縮而對KCl誘導的內皮完整或去內皮的血管收縮均無效。為了進一步確定GFA舒血管的作用的機制是否與抑制內鈣釋放有關，又使用無鈣液預處理去內皮的胸主動脈。發現血管環經過無鈣液及GFA共育后，PE引起的收縮反應明顯受到抑制，提示GFA對非內皮途徑的血管舒張作用可能與抑制血管平滑肌細胞內質網鈣釋放有關，而與門控鈣離子通道引起外鈣內流無關。

另一種血管擴張途徑為內皮依賴性舒張。在大血管中內皮細胞主要通過分泌血管舒張因子一氧化氮(nitric oxide，NO)和前列環素(prostacyclin，PGI2)而擴散到血管平滑肌細胞達到血管舒張作用［11］。為了進一步驗證GFA引起血管舒張是否具有內皮依賴性。本實驗分別選用內皮完整和去內皮組進行比較，發現GFA對PE誘導的內皮完整血管有明顯的舒張作用(P＜0.01)，而去內皮的血管的舒張作用不明顯(P＞0.05)，提示內皮系統途徑可能參與了GFA的舒張血管作用。NO是由血管內皮中的一氧化氮合酶(eNOS)催化L-精氨酸而來，NO作為信號分子激活血管平滑肌細胞內的鳥苷酸環化酶(guanylate cyclase，GC)進而產生環磷鳥苷酸(cGMP)，使細胞內鈣離子濃度降低，從而使血管舒張［12］。實驗結果表明，選用非選擇性NOS抑制劑L-NAME或鳥苷酸環化酶抑制劑亞甲藍均可明顯抑制GFA的舒張血管作用，說明擴血管機制可能是通過NO－GC－cGMP途徑介導的，是內皮依賴性的。此外，血管內皮細胞還可在花生四烯酸限速酶環氧合酶(cyclooxygenase，COX)的作用下，把花生四烯酸轉變為另一種內皮舒張因子前列環素(prostacyclin，PGI2)，它可作用于血管平滑肌產生環磷腺苷酸(cAMP)而使血管舒張［13－14］。實驗證明，在使用非特異性環氧合酶抑制劑吲哚美辛孵育后，GFA的血管舒張功能明顯降低，提示GFA的擴血管作用也可能由前列環素介導，環氧合酶途徑亦參與了GFA擴血管作用。

心率的加快可增加血流對血管的剪切力，直接對內皮造成損傷;同時也能加速新陳代謝及心肌耗氧量、產生自由基，間接損傷血管內皮［15］。GFA是從中藥關白附中提取分離的二帖類生物堿，其靜脈注射液是我國獨立研制的一類新藥，可通過終止房顫、陣發性室上性心動過速，明顯延長心房有效不應期而具有良好的抗心律失常作用［16－17］。雖然關白附是否可通過抗心律失常間接保護血管內皮有待進一步的論證;但本次研究證明了關白附可直接作用于血管，產生舒張作用。具體機制有非內皮依賴性舒張機制:抑制平滑肌細胞內質網鈣釋放，及部分內皮依賴性舒張機制:①參與NO－GC－cGMP途徑，激活eNOS或鳥苷酸環化酶，增加NO生成量;②激活環氧合酶，增加PGI2含量。該發現對GFA在心血管系統藥理作用的進一步開發及心血管疾病的合理臨床用藥指導有重要意義。

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