嘌呤核苷磷酸化酶檢測體系優化及芒果苷對其活性的影響

袁麗仙，牛艷芬，高麗輝，董馨怡，李 玲，劉 旭

(昆明醫學院1.生物醫學工程研究中心、2.科研實驗中心，云南昆明 650500)

尿酸(uric acid，UA)是人類嘌呤代謝的終末產物，任何原因引起UA生成增多和(或)排泄減少均可導致高尿酸血癥。通常高尿酸血癥被認為是痛風的標志，據統計約有5% ～12%的高尿酸血癥患者最終可發展為痛風［1］。近年來隨著我國人民生活水平的提高，飲食結構的改變、肥胖者的增加，痛風的發病率已較15年前增長了15～30倍，成為我國常見多發的疾病之一。高尿酸血癥不僅是痛風最重要的生化基礎，最近還發現它與代謝紊亂綜合征密切相關，是心血管疾病、高血壓、腎臟疾病等獨立的危險因素［2－3］，也已成為嚴重威脅人類健康的代謝性疾病，聯合國將其列為21世紀的20大頑癥之一。

尿酸是由次黃嘌呤、黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下生成的。內源性的嘌呤代謝紊亂導致尿酸生成過多，是原發性高尿酸血癥的重要原因之一。除黃嘌呤氧化酶外，嘌呤代謝過程中還有許多酶的參與，其中嘌呤核苷磷酸化酶(purine nucleoside phosphorylase，PNP)也是嘌呤代謝途徑中的關鍵酶之一，它催化腺苷、肌苷和鳥苷生成尿酸的前體物質腺嘌呤、次黃嘌呤和鳥嘌呤，它的活性異常可導致尿酸生成增加，形成高尿酸血癥。

芒果苷(mangiferin，Fig 1)系四羥基吡酮的碳糖苷、屬雙苯吡酮類化合物，存在于多種植物中，資源非常豐富。國內外學者對芒果苷的藥理學活性進行了較為廣泛的研究，發現芒果苷具有一定的抗氧化、抗糖尿病、抗腫瘤、抗病毒和肝保護等多種藥理作用［4－8］。本課題組前期研究發現芒果苷具有降低尿酸的作用，已獲國家發明專利，其降尿酸作用與抑制黃嘌呤氧化酶的活性有關［9］，但對PNP是否有抑制作用尚未見報道，因此，本文參照文獻報道對PNP濃度、底物濃度及保持酶穩定性的DTT濃度進行優化，并研究芒果苷及其苷元對PNP活性的影響。

Fig 1 Chemical structure of mangiferin

1 材料及儀器

1.1主要試劑PNP(批號:57K1480)、鳥苷(批號:106K1848)均為美國Sigma公司產品，PNP蛋白含量57.8%，酶活性31 kU·g－1Pro;二硫蘇糖醇(DTT)為Merck公司產品;其他試劑均為國產分析純。

1.2供試藥品芒果苷由昆明醫學院生物醫學工程研究中心提供，純度≥95%，芒果苷元由昆明制藥集團股份有限公司提供，純度≥98%，臨用前用DMSO配制，終濃度＜1%。

1.3儀器SPECTRA MAX190全波長紫外－可見光酶標儀為美國Molecular Devices公司產品;紫外檢測板(96孔)為美國Costar公司產品。

2 實驗方法

2.1體外PNP活性檢測體系的建立及優化參照文獻［10－11］，在96孔紫外檢測板中加入不同濃度的PNP和 DTT 于 50 mmol·L－1KH2PO4-NaOH(pH 7.5)的緩沖液中，25℃溫育15 min，再加入不同濃度的鳥苷啟動反應，反應總體積為100 μl。在25℃、波長258 nm處動態監測反應，確定反應的最佳PNP、鳥苷、DTT濃度及反應時間。

2.2芒果苷及苷元對PNP活性的影響以優化后的反應體系研究芒果苷和芒果苷元對PNP活性的影響，即在96孔紫外檢測板中加入系列濃度的芒果苷(苷元)、250 U·L－1PNP、0.5 mmol·L－1DTT，于25℃預溫 15 min 后加入鳥苷 400 μmol·L－1啟動酶促反應，波長258 nm處動態監測15 min，每30 s測1次，以15 min時的測量數據按下列公式計算出酶活性抑制率:酶活性抑制率/%=(酶組OD－樣品組OD)/(酶組OD－空白組OD)×100%。

2.3統計學處理數據均用±s表示，采用軟件GraphPad Prism 5.0進行統計學分析。

3 結果

3.1體外PNP活性檢測體系的建立及優化

3.1.1探索最佳PNP濃度如Fig 2所示，當底物鳥苷濃度為 400 μmol·L－1，PNP 濃度為 125 U·L－1時，吸光度值(A)減少較緩慢，且變化不大，而酶濃度在250與500 U·L-1時，吸光度值減少量均較明顯，能較好的反映酶的活力，且兩者的反應曲線相似，故本實驗PNP濃度采用250 U·L－1。

3.1.2探索最佳鳥苷濃度由Fig 3可知，隨著鳥苷濃度的增加，底物的消耗量逐漸增多，對應的吸光值變化也逐漸增大，而當鳥苷濃度增加至400 μmol·L－1以上時，其吸光度值變化量減小，由此可見反應中的PNP可被濃度為400 μmol·L－1鳥苷完全飽和，在此條件下可完全反映PNP的活力。故本實驗體系中鳥苷濃度采用 400 μmol·L－1。

3.1.3探索最佳DTT濃度隨著DTT濃度的增加，反應時間縮短，反應速度加快(見Fig 4)。為便于觀測反應情況，更好地體現PNP的活力，故選用DTT 的濃度為 0.5 mmol·L－1。

Fig 2 Time-course of the PNP activity(n=4)

Fig 3 Effect of guanosine on the time-course of PNP activity(n=4)

Fig 4 Effect of DTT on the time-course of PNP activity(n=4)

3.1.4探索反應時間上述采用的最佳PNP濃度250 U·L－1、最佳鳥嘌呤核苷濃度400 μmol·L－1及最佳DTT濃度所示的吸光度－時間曲線中可看出，反應達到平臺期的時間為7～8 min，考慮到后續反應中受試樣品對酶的影響，故延長反應時間，本實驗采用動態監測反應時間為15 min。

Fig 5 Time-course of 250 U·L－1PNP(n=4)

3.2芒果苷及苷元對PNP活性的影響在PNP濃度為 250 U·L－1、底物鳥苷為 400 μmol·L－1、DTT為0.5 mmol·L－1的反應條件下，動態監測15 min，觀察芒果苷及其苷元對PNP活性的影響。結果表明在本實驗條件下，芒果苷及其苷元在濃度高達100 μmol·L－1時，對 PNP 的活性沒有明顯抑制作用(Fig 6，7)，反應15 min時的抑制率見Tab 1;溶媒對照1%DMSO對PNP活性沒有影響，抑制率為0.18%。

4 討論

PNP參與了嘌呤代謝，是尿酸生成途經中的關鍵酶之一。PNP活性增加，可以促進尿酸前體物質次黃嘌呤和黃嘌呤的生成增加，最終導致尿酸生成增多，促進高尿酸血癥的發生及痛風的形成;PNP的過度抑制則引起體內肌苷、鳥苷等的堆積，而高濃度的鳥苷能抑制淋巴細胞的增殖［12］，因而，維持適當的PNP活性具有重要的意義。

Tab 1 Effects of mangiferin and its aglycone on the activity of purine nucleoside phosphorylase in vitro(±s，n=4)

Tab 1 Effects of mangiferin and its aglycone on the activity of purine nucleoside phosphorylase in vitro(±s，n=4)

Mangiferin Aglycone 1×10－7 Concentration/mol·L －1 Inhibition ratio/%0.74 ±0.21 0.55 ±0.18 1 ×10 －6 0.51 ±0.16 0.98 ±0.33 1 ×10 －5 0.69 ±0.12 0.72 ±0.21 1×10－40.46 ±0.18 0.77 ±0.27

Fig 6 Effect of mangiferin on the time-course of PNP activity(n=4)

Fig 7 Effect of aglycone on the time-course of PNP activity(n=4)

腺苷、肌苷和鳥苷均可作為PNP的底物，目前PNP活性的檢測方法主要有以鳥苷為底物，在258 nm檢測底物消耗的紫外檢測法［10］，以及以肌苷為底物，與黃嘌呤氧化酶聯合，以尿酸生成量為觀察指標的紫外檢測法［11］，前者較為簡便，因此，選擇鳥苷作為PNP的底物，采用紫外法測定PNP的活性。本實驗中PNP為商品化的高純度酶，有較好的活性31 kU·g－1Pro。根據文獻［10－11］，對底物、酶、DTT 濃度進行優化，結果表明在PNP濃度為250 U·L－1、底物鳥苷為 400 μmol·L－1、DTT 0.5 mmol·L－1的反應條件下，PNP表現出較好的活性，有利于酶抑制劑的研究。

我們前期研究發現芒果苷灌胃給藥能降低氧嗪酸鉀所致高尿酸血癥小鼠的血清尿酸水平，其機制與抑制黃嘌呤氧化脫氫酶的活性有關［9］，在此基礎上，進一步研究芒果苷及其代謝產物苷元對嘌呤代謝途徑中的其他關鍵酶的影響，以明確芒果苷及苷元的降尿酸作用機制，結果顯示在本實驗條件下，芒果苷及其苷元在濃度高達100 μmol·L－1時，對PNP的活性沒有抑制作用，提示芒果苷及苷元的降尿酸作用機制與抑制PNP的活性無關，可能對嘌呤代謝途徑中的關鍵酶黃嘌呤氧化脫氫酶有較高的選擇性。

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