四丁基丙二胺對人MG63骨髓瘤細胞增殖、凋亡和遷移能力的影響

張賀吉，王 凱，韓 鈺，楊建林，王艷林

(1.三峽大學醫學院，三峽大學分子生物學研究所，湖北宜昌 443002;2.武漢工程大學，湖北省新型反應器與綠色化學工藝重點實驗室，湖北武漢 430073)

多胺(腐胺、精瞇、精胺)是存在于真核細胞中的有機小分子，廣泛參與細胞增殖、分化和基因表達與調控等重要生理功能［1－3］。近來研究發現，腫瘤細胞的快速生長依賴于細胞內異常升高的多胺含量，由此多胺代謝途徑成為抗腫瘤治療和抗腫瘤藥物設計的新靶點［4－5］。多胺類似物是與天然多胺具有相似結構的小分子化合物，它們或者通過干擾多胺代謝而耗竭細胞內多胺庫，或者競爭性抑制多胺的正常功能而阻遏腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞凋亡［6－9］。正在研究中的一批多胺類似物在體外雖能有效抑制腫瘤細胞生長，但高效低毒、能用于人體腫瘤治療的類似物卻為數不多。研發和篩選新的多胺類似物用于臨床抗腫瘤治療仍為當前的熱點研究領域。四丁基丙二胺(tetrabutyl propanediamine，TBP)是本課題組協作單位武漢工程大學新合成的一種腐胺類似物，具有潛在的抗腫瘤藥理活性。本研究分析了TBP對人MG63骨髓瘤細胞生長，凋亡及遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1材料人骨髓瘤細胞株MG63由本實驗室保存，多胺類似物四丁基丙二胺(tetrabutyl propanediamine，TBP)由武漢工程大學王凱副教授合成，PVDF膜為Millipore公司產品;ECL試劑盒為Thermo公司產品;兔抗人Bax和細胞色素C多克隆抗體為Santa Cruz公司產品，羊抗兔IgG-HRP為Jackson公司產品。其它化學試劑來自Invitrogen和Sigma公司。Transwell細胞培養板為Corning公司產品。GelLogic-200凝膠圖像分析儀為Kodak公司產品，EPLCS XL流式細胞分析儀為Becman-Coulter公司產品，全波長酶標儀為Thermo公司產品。

1.2方法

1.2.1MTT法測定細胞增殖速度取對數生長期的MG63細胞，調整細胞濃度至2×107·L－1后接種于96孔板中，每孔100 μl。37℃培養24 h后，向孔內加入含不同濃度TBP的DMEM培養液100 μl并繼續培養。在設定的培養時間點去培養液，加入含200 mg·L－1MTT的無血清培養液，37℃孵育4 h后去上清，然后加入 DMSO 200 μl·well－1，室溫振搖20 min溶解結晶，570 nm波長下檢測每孔的吸光值A。細胞生存率/%=A藥物/A對照×100%。

1.2.2Western blot法鑒定相關基因在蛋白水平上的表達將收集的培養細胞分為兩份，一份用細胞裂解液 A(10 mmol·L－1HEPES，pH 7.2，210 mmol·L－1D-mannitol，70 mmol·L－1sucrose，5 mmol·L－1sodium succinate，0.2 mmol·L－1EGTA，100 mg·L－1digitonin)在冰浴裂解20 min，室溫保溫5 min后，600 r·min－1離心 5 min去細胞核，將上清轉移至另一試管中，12 000 r·min－1離心10 min去線粒體，取上層裂解液用于細胞色素C(Cyt-C)檢測。另一份用細胞裂解液 B(20 mmol·L－1Tris-HCl，pH 8.0，150 mmol·L－1NaCl，2 g·L－1NP-40)裂解、離心取上清用于Bax的檢測。上述裂解液中的蛋白經10%的SDS-PAGE分離后，電轉移至PVDF膜上。膜先后與第一抗體和HRP標記的第二抗體作用，ECL法示蹤目標蛋白。實驗中以β-actin作為內參照蛋白。

1.2.3流式細胞術(FCM)檢測細胞周期收集對數生長期細胞，用含75%乙醇和0.5 mmol·L－1EDTA的PBS重懸細胞，4℃固定30 min后2 000 r·min－1離心 5 min 棄上清，用含1 g·L－1Triton X-100和50 mg·L－1RNAse的 PBS混合液500 μl重懸細胞，加入 0.5 g·L－1PI(Propidium Iodide)90 μl，37℃避光保溫30 min，尼龍膜過濾，流式細胞分析儀檢測。

1.2.4Transwell技術分析腫瘤細胞的遷移能力無血清DMEM培養基培養MG63細胞4 h，收集細胞后用含2 g·L－1BSA的DMEM基礎培養基重懸細胞，調整細胞密度為 2.5 ×108·L－1，取 200 μl細胞懸液鋪在Transwell上室中，同時加入TBP(終濃度為 40 μmol·L－1)，下室內加入 800 μl含 10% 胎牛血清的DMEM培養基，37℃培養18 h后，PBS清洗小室細胞2次，4%多聚甲醛室溫固定小室膜30 min，PBS清洗3次后，蘇木精染細胞核5 min，清水浸泡20 min，用棉簽輕輕擦拭上室內側面的細胞，同時清水沖洗3～5遍，用鑷子撥下小室的膜，下側面向上平鋪于載玻片，顯微鏡下隨機觀察5個視野并做細胞計數，取其平均值代表細胞的遷移能力。

1.2.5統計學分析實驗數據采用組間t檢驗經SPSS 2.0軟件進行統計分析，結果用±s表示。

2 結果

2.1TBP對MG63細胞增殖的影響用MTT法檢測了TBP對MG63細胞生長的影響，結果顯示，TBP能明顯抑制MG63細胞生長，抑制效應呈濃度和時間依賴性(Tab 1)。

2.2TBP對腫瘤細胞生長周期的影響分別收集40 μmol·L－1TBP 處理48 h 和對照 MG63 細胞，利用流式細胞儀檢測細胞周期變化，結果顯示，TBP處理MG63細胞后，G1期和G2期細胞增加但S期細胞明顯減少，同時出現大量凋亡細胞(亞凋亡峰)，提示多胺類似物TBP可能通過干擾細胞周期而影響MG63細胞的正常生長，并同時誘導MG63骨肉瘤細胞發生凋亡(Tab 2，Fig 1)。

Fig 1 Effect of TBP on cell cycle and apoptosis in MG63 cells

Tab 1 Effect of TBP on cell survival rate in MG63 cells with MTT method(±s，n=3)

Tab 1 Effect of TBP on cell survival rate in MG63 cells with MTT method(±s，n=3)

The cells were treated by 0～40 μmol·L－1TBP for 24～72 h.＊＊P ＜0.01 vs 0 μmol·L －1TBP group.

TBP/μmol·L －124 h 48 h 72 h 0 100 ±1.50 100 ±1.59 100 ±1.12 10 107.77 ±2.10 105.47 ±1.60 87.38 ±0.69＊＊20 90.08 ±1.53＊＊ 93.54 ±1.26＊＊65.63 ±2.85＊＊40 74.58 ±2.10＊＊ 50.33 ±1.14＊＊21.86 ±4.50＊＊80 59.44 ±1.88＊＊ 35.75 ±1.93＊＊15.58 ±1.29＊＊

Tab 2 Effect of TBP on cell cycle in MG56 cells with flow cytometry method(±s，n=3)

Tab 2 Effect of TBP on cell cycle in MG56 cells with flow cytometry method(±s，n=3)

The cells were treated by 40 μmol·L －1TBP for 48 h.＊＊P ＜0.01 vs control group

MG63-control 75.61 ±0.55 12.57±0.40 11.82±0.45 0.46 ±0.06 MG63-TBP 79.68 ±1.42＊＊16.24±0.43＊＊ 4.08±0.79＊＊11.74 ±1.44＊＊

2.3TBP對DNA片段化的影響40 μmol·L－1TBP處理MG63細胞48 h后，分別提取處理細胞和對照細胞胞質中的DNA，然后對樣本進行Agarose凝膠電泳分析，結果顯示，TBP處理導致凋亡細胞典型的DNA的片段化現象(Fig 2)。

Fig 2 Cell apoptosis induced by TBP with DNA degradation assay

2.4TBP對凋亡相關蛋白的影響用Western blot分析了TPB處理后，MG63細胞質中凋亡相關蛋白Bax和Cyt C水平的影響。結果發現，TBP導致促凋亡蛋白Bax蛋白水平增加和Cyt C從線粒體的釋放(Fig 3)。

2.5藥物對腫瘤細胞遷移能力的影響用Transwell技術分析了TBP對MG63細胞遷移能力的影響，結果顯示，TBP處理細胞降低MG63細胞的遷移能力，與對照細胞比較，差異具有顯著性(Tab 3)。

Fig 3 Bax and Cyt C levels in the cytosol of MG63 cells with Western blot

Tab 3 Effect of TBP on cell migration in MG63 cells(cell number/Each field of vision，±s，n=5)

Tab 3 Effect of TBP on cell migration in MG63 cells(cell number/Each field of vision，±s，n=5)

The cells were treated by 40 μmol·L －1TBP for 48 h.＊＊P ＜0.01 vs control group

Group Migrated cell MG63-control 43.7 ±9.29 MG63-TBP 5.2 ±1.58＊＊

3 討論

通過控制多胺代謝和干擾多胺功能而抑制腫瘤生長是抗腫瘤藥物設計的新策略，其中抗腫瘤多胺類似物的合成與篩選為當前的研究熱點，本研究應用的TBP即為新合成的一種腐胺對稱性修飾物。為探討TBP作為抗腫瘤藥物的潛在價值，本研究以人骨髓瘤MG63細胞為實驗對象，分析了TBP對瘤細胞增殖、遷移和凋亡的影響。結果證實，TBP能有效抑制MG63細胞的生長，且這種抑制呈時間和劑量依賴性。隨后的細胞周期和細胞凋亡分析提示，上述抑制作用可能與TBP抑制細胞周期和誘導細胞凋亡密切相關。多胺能與DNA分子結合，參與DNA構象轉換，結構穩定、染色質凝縮和解凝縮等過程，以及調節轉錄因子與DNA元件間的相互作用，并由此加快DNA復制和細胞分裂［10－12］。作為一種多胺的結構類似物，TBP可能干擾了上述多胺的正常功能，導致DNA復制障礙，細胞周期抑制，S期細胞明顯減少。腫瘤細胞的典型特征之一是喪失發生凋亡的能力，因而誘發腫瘤細胞凋亡是抗腫瘤藥物設計的重要目標。細胞凋亡分為外源性凋亡和內源性凋亡兩大類，而線粒體結構和功能的改變是內源性細胞凋亡的核心事件［13］。在本研究中，TBP處理導致MG63細胞發生典型的DNA片段化現象和流式細胞分析中亞凋亡峰(Sub-G1)的出現，以及線粒體促凋亡蛋白Bax和Cyt C在胞質中含量增加，均提示TBP激活了線粒體介導的凋亡途徑。

上述結果提示，TBP有作為骨髓瘤治療藥物的臨床應用前景。在后續研究中，我們將進一步探討TBP抗腫瘤藥理活性的分子機制，特別是對多胺代謝的影響，以及在動物水平上評價該藥的安全性。

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