通心絡(luò)超微粉對缺血性腦卒中大鼠微血管新生影響的實驗研究

常麗萍，張秋燕，韓建科，魏 聰，賈振華，3

(1.河北以嶺醫(yī)藥研究院，國家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)研究室(心腦血管絡(luò)病)，2.河北省絡(luò)病重點(diǎn)實驗室，河北石家莊 050035;3.國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)絡(luò)病學(xué)重點(diǎn)學(xué)科，河北石家莊 050091)

腦血管病已成為危害我國中老年人身體健康的主要疾病。最近調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，在腦血管病患者中缺血性腦卒中占68%［1］。因此，提高缺血性腦卒中的治愈率，降低致殘率，已成為當(dāng)前一項刻不容緩的重要任務(wù)。腦缺血發(fā)生后機(jī)體通過增加受損區(qū)的氧供代償這種破壞性的影響，其中一種重要的機(jī)制就是誘導(dǎo)血管新生，但機(jī)體的這種反應(yīng)尚不足以改善腦缺血后的神經(jīng)功能康復(fù)。中醫(yī)藥在促進(jìn)腦缺血后微血管新生方面具有優(yōu)勢，可彌補(bǔ)這種不足，促進(jìn)腦缺血后血管生成，從而有利于神經(jīng)功能的恢復(fù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物健康SPF級♂ SD大鼠48只，體質(zhì)量110～140 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號:SCXK(京)2006-2009。飼養(yǎng)在河北以嶺醫(yī)藥研究院藥理實驗室，光照12 h/d，溫度20℃ ～23℃，相對濕度40% ～60%。

1.2藥物和試劑通心絡(luò)(Tongxinluo，TXL)超微粉(由人參、水蛭、全蝎、蜈蚣、蟬蛻、赤芍、冰片等組成的棕褐色粉末)，0.076 g(生藥)/kg體質(zhì)量，由石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司提供，批號20090430);尼莫地平(拜耳醫(yī)藥保健公司提供，批號H20003010);NO試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20100519);VEGF ELISA試劑盒(上海藍(lán)基生物科技有限公司，批號Z1ZFBZAA02);CD31羊抗鼠多克隆抗體(美國Santa Cruz公司提供，批號sc-1506)。

1.3主要儀器SANYO超低溫冰箱(日本三洋公司);SZ-PT解剖顯微鏡(日本OLYMPUS公司);DT-2000電子天平(美國雙杰兄弟(集團(tuán))有限公司);XD711酶標(biāo)儀(上海迅達(dá)醫(yī)療器械公司)。

1.4模型制作參照文獻(xiàn)［2］，10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，側(cè)臥位，于左側(cè)眼眶后至耳的中點(diǎn)縱形切開皮膚1.5 cm左右，沿顳骨緣剪開顳肌筋膜，完全暴露顳骨的顳鱗和蝶骨大翼，在顴弓上方顳鱗與蝶骨大翼交界處鉆孔，用血管鉗向下方咬骨做3～5mm骨窗，切開硬膜可見橫過嗅束向上行走的大腦中動脈，用11/0號手術(shù)線結(jié)扎大腦中動脈中段。假手術(shù)組大鼠只挑開腦膜，不結(jié)扎血管，于手術(shù)創(chuàng)面撒少許青霉素藥粉，隨后分層縫合肌肉和皮膚，單籠飼養(yǎng)。

1.5動物分組及給藥參照Bederson等［3］方法稍加改進(jìn)，對大鼠神經(jīng)功能障礙程度進(jìn)行評分:0分，無任何神經(jīng)功能喪失;1分，右前肢不能充分伸展;2分，提尾時向右環(huán)形或旋轉(zhuǎn)運(yùn)動;3分，向右轉(zhuǎn)圈，成追尾狀或向右傾倒;4分，不能自然行走或無自發(fā)活動意識障礙者。神經(jīng)功能障礙評分為1～3分的大鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，其余予以剔除。分為假手術(shù)組(Sham)、模型組(Model)、通心絡(luò)大劑量組(TXLH)、中劑量組(TXL-M)、小劑量組(TXL-L)、尼莫地平組(Nim)。其中假手術(shù)組和模型組以等體積的生理鹽水灌胃，通心絡(luò)大、中、小劑量組相當(dāng)于臨床用量的16、8、4 倍，分別以 1.6、0.8、0.4 g·kg－1·d－1灌胃，即 2.4、1.2、0.6 g(生藥)·kg－1·d－1灌胃，尼莫地平組以10 mg·kg－1·d－1，1 次/d 灌胃。各組于給藥14 d后每組處死8只動物進(jìn)行檢測。

Fig 1 Effects of Tongxinluo on microvascular density CD31in cerebral cortex ischemia area(×400)

1.6觀察指標(biāo)及檢測方法

1.6.1大腦皮層微血管密度觀察大鼠心臟灌注固定后立即取腦，置于4%多聚甲醛固定48h后，石蠟包埋，于視交叉前緣開始作8 μm厚冠狀切片。SP法CD31免疫組化染色，DAB顯色。

1.6.2血管新生相關(guān)因子檢測

1.6.2.1血清 NO、VEGF檢測 常規(guī)分離血清，ELISA放射免疫方法檢測VEGF含量;硝酸還原酶法檢測NO。實驗操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.6.2.2腦組織中VEGF表達(dá)的檢測 大鼠心臟灌注固定后立即取腦，置于4%多聚甲醛固定48h后，石蠟包埋，于視交叉前緣開始作8 μm厚冠狀切片。SP法VEGF免疫組化染色，DAB顯色。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，進(jìn)行正態(tài)性檢驗，如正態(tài)分布數(shù)據(jù)用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，若方差齊，兩兩比較采用最小顯著差法(least significant difference，LSD)，若方差不齊則采用Dunnett's T3檢驗行兩兩比較;如不符合正態(tài)分布，則用非參數(shù)檢驗進(jìn)行統(tǒng)計，所有數(shù)據(jù)均用±s表示。

2 結(jié)果

2.1通心絡(luò)對腦缺血大鼠皮層微血管密度的影響

CD31蛋白陽性表現(xiàn)為棕黃色染色，主要在大腦缺血皮層區(qū)內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)。正常腦組織中有少數(shù)散在分布，模型組蛋白表達(dá)增強(qiáng)，通心絡(luò)大、中劑量組、尼莫地平組CD31蛋白陽性分布密集且著色明顯，均強(qiáng)于模型組，其中以通心絡(luò)大劑量組為優(yōu)。結(jié)果見Fig 1。

2.2血清NO，VEGF水平檢測結(jié)果與模型組比較，通心絡(luò)大劑量組、通心絡(luò)中劑量組大鼠血清NO水平明顯提高(P＜0.05，P＜0.01)，且通心絡(luò)大劑量組優(yōu)于通心絡(luò)中劑量組(P＜0.05);通心絡(luò)大劑量組與通心絡(luò)小劑量組、尼莫地平組比較NO水平明顯提高(P＜0.01)。與模型組比較，通心絡(luò)大劑量組大鼠血清VEGF水平明顯提高(P＜0.01)，通心絡(luò)大劑量組優(yōu)于通心絡(luò)小劑量組和尼莫地平組(P＜0.05，P＜0.01)。結(jié)果見 Tab 1。

2.3腦組織VEGF蛋白表達(dá)結(jié)果VEGF蛋白在腦組織皮層區(qū)神經(jīng)元、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞均陽性表達(dá)。正常腦組織僅有少量表達(dá)，與模型組相比，通心絡(luò)大劑量組表達(dá)明顯加強(qiáng)，其余各用藥組雖然表達(dá)有所加強(qiáng)，但差異無顯著性。結(jié)果見Fig 2。

Fig 2 Effects of Tongxinluo on protein expression of VEGF in cerebral cortex ischemia area(×400)

Tab 1 NO/VEGF content of ischemic stroke rats in serum(±s，n=6)

Tab 1 NO/VEGF content of ischemic stroke rats in serum(±s，n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs TXL-L group;◆◆P ＜0.01 vs Nim group;△P ＜0.05 vs TXL-M group

Group NO/μmol·L －1 VEGF/ng·L －1 Sham 23.21 ±3.24 12.91 ±1.77 Model 21.24 ±3.93 14.22 ±1.00 TXL-H 48.07 ±4.20＊＊△##◆◆ 26.23 ±4.80＊＊#◆◆TXL-M 35.57 ±1.70* 19.73 ±1.75 TXL-L 29.76 ±3.41 16.95 ±0.98 Nim 27.70 ±3.21 13.60 ±1.63

3 討論

有研究表明，腦梗死患者腦組織中血管新生從梗死后3～4 d開始［4］，新形成的血管明顯改善缺血區(qū)血流灌注，促進(jìn)腦缺血后的神經(jīng)功能恢復(fù)［5－6］，這說明促進(jìn)缺血區(qū)微血管新生對保護(hù)神經(jīng)元具有重要作用，血管新生為腦梗死的治療開辟了一條再血管化的新途徑。

目前發(fā)現(xiàn)血管新生相關(guān)因子很多，其中包括VEGF、NO等成血管因子。VEGF是內(nèi)皮細(xì)胞特異性的促有絲分裂原和趨化因子，通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，加速新生血管的形成。NO是眾多血管生長因子的下游介質(zhì)，兩者相互協(xié)調(diào)，共同作用。最近Babaei等［7］研究表明來自內(nèi)皮的NO是Ang-1誘導(dǎo)血管生成所必需的，通過NO/cGMP路徑起作用。NO能夠延長內(nèi)皮細(xì)胞生命周期，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移力，具有調(diào)節(jié)血管生成因子，刺激血管生成的作用。存在于腦組織中的NO、VEGF一旦受到缺血、缺氧或炎癥等刺激，開始大量合成并釋放入血，故血清NO、VEGF含量可以有效反映腦組織中NO、VEGF的合成狀態(tài)。應(yīng)用絡(luò)病理論指導(dǎo)血管病變防治研究研制出的創(chuàng)新藥物通心絡(luò)膠囊［8－13］可以保護(hù)腦組織毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)缺血性腦卒中毛細(xì)血管新生，改善腦微小循環(huán)障礙，減輕腦水腫，縮小腦梗死面積，改善神經(jīng)功能缺損，抑制其凋亡，初步顯示出具有促進(jìn)治療性血管新生的作用。本研究結(jié)果顯示通心絡(luò)能夠增加毛細(xì)血管密度，升高血清NO，VEGF水平，促進(jìn)腦組織中VEGF表達(dá)，以上結(jié)果提示通心絡(luò)可能通過上調(diào)缺血腦組織中血管生長因子NO、VEGF表達(dá)，從而促進(jìn)腦微血管新生，改善神經(jīng)功能恢復(fù)。

［1］饒宜光，池洪珊，黃文繁，等.深圳市社區(qū)人群腦卒中發(fā)病類型的分布特征［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2007，34(9):1611 －2.

［1］Yi X G，Chi H S，Guang W F，et al.Distribution characteristics of stroke types in urban area in Shenzhen City［J］.Modern Preventive Med，2007，34(9):1611－2.

［2］Majid A，He Y Y，Gidday J M，et al.Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains editorial comment［J］.Stroke，2000，31(11):2707 －14.

［3］Bederson J B，Pitts L H，Tsuji M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of a neurologic examination［J］.Stroke，1986，17(3):472 －6.

［4］Szpak G M，Lechowicz W，Lewandowska E，et al.Border zone neovascularization in cerebral ischemic infarct［J］.Folia Neuropathol，1999，37(4):264 －8.

［5］Zhang Z G，Zhang L，Jiang Q，et al.VEGF enhances angiogenesis and promotes blood-brain barrier leakage in the ischemic brain［J］.J Clin Invest，2000，106(7):829 －38.

［6］Wei L，Erinjeri J P，Rovainen C M，et al.Collateral growth and angiogenesis around cortical stroke［J］.Srtoke，2001，32(9):2179－84.

［7］Babaei S，Kuliszewka K T，Zhang Q，et al.Angiogenic actions of angiopoietin-1 require endothelium-derived nitric oxide［J］.Am J Pathol，2003，162(6):1972 －36.

［8］趙永厚，唐燕紅，聞 名，等.通心絡(luò)對大鼠急性缺血性卒中腦微小循環(huán)障礙的影響［J］.上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2006，20(3):37－9.

［8］Zhao Y H，Tang Y H，Wen M，et al.Effect of Tongxinluo on cerebral microcirculation disturbance in acute ischemic stroke rats［J］.Acta Univ Tradit Med Sin Pharmacol Shanghai，2006，20(3):37－9.

［9］曾麗莉，沈帆霞，陳生弟，等.通心絡(luò)對大鼠腦缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡的影響［J］.中藥藥理與臨床，2007，23(4):40－2.

［9］Zeng L L，Shen F X，Chen S D，et al.Effect of Tongxinluo on reperfusion injury cell apoptosis in cerebral ischemia rats［J］.Pharmacol Clini Chin Mat Med，2007，23(4):40－2.

［10］呂 昀，李學(xué)玲，李文戰(zhàn)，等.通心絡(luò)對腦梗死大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用［J］.中國實用神經(jīng)疾病雜志，2009，12(15):37－8.

［10］Lü Y，Li X L，Li W Z，et al.Protective effects of Tongxinluo on neurological fanction in cerebral rats infarction［J］.Chin J Practical Nervous Dis，2009，12(15):37 －8.

［11］梅愛農(nóng)，王 玨，湛彥強(qiáng)，等.通心絡(luò)膠囊對腦梗死大鼠腦皮質(zhì)血管新生和皮層神經(jīng)元凋亡的影響［J］.實用醫(yī)學(xué)雜志，2006，22(3):267－70.

［11］Mei A N，Wang J，Zhan Y Q，et al.Effect of Tongxinluo Capsule on cerebral infarction rat with cerebral cortex angiogenesis and cortical neurons apoptosis［J］.J Practical Med，2006，22(3):267－70.

［12］董為偉，石正洪.通心絡(luò)促腦缺血后血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的實驗研究［N］.中國醫(yī)學(xué)論壇報，2003:13－4.

［12］Dong W W，Shi Z H.Experimental study on vascular endothelial growth factor expression of Tongxinluo after cerebral ischemia［N］.China Med Trib，2003:13 －4.

［13］張志慧，吳以嶺.通心絡(luò)對Aβ1-42損傷人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞HIF-1α、VEGF 表達(dá)的干預(yù)作用［J］.中國藥理學(xué)通報，2010，26(1):124－7.

［13］Zhang Z H，Wu Y L.Regulating effect of Tongxinluo on HIF-1α，VEGF generated by the human brain microvascular endothelial cells induced by β-amyloid1-42［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(1):124－7.