促紅細胞生成素變異體與脊髓損傷的相關性

顧 兵，王爍宇，李華南，王 俊，金建波

(1.江西科技師范大學生命科學學院，江西南昌 330013;2.江西中醫學院附屬醫院，江西南昌 330006)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)的發病機制比較復雜，一般分為原發性損傷和繼發性損傷。前者是指脊髓直接的機械損傷，一旦發生便無法控制。具體表現有撞擊后持續性壓迫、撞擊后短暫性壓迫、牽張損傷和裂傷(或橫斷傷)4種形態學類型［1］。直接的損傷包括創傷即刻造成的神經元大量死亡，傳導束斷裂以及血-脊髓屏障破壞所引起的脊髓內環境失衡等，繼而引起興奮性毒性反應、自由基形成、微循環障礙、炎癥反應和細胞凋亡等一系列繼發性損害。目前SCI的治療藥物研究主要集中于糖皮質激素、神經節苷脂、米諾環素、Cethrin(一種Rho GTPase的抑制劑)、利魯唑(鈉離子通道抑制劑，又是谷氨酸鹽拮抗劑)以及神經營養因子等一些神經保護劑［2］，它們通過阻斷髓鞘抑制因子、抗凋亡、阻斷離子通道等途徑而起到神經保護作用［3-4］。甲基強的松龍是唯一被美國FDA批準的標準藥物，作為常規藥物用于治療SCI始于上世紀90年代。然而，在使用的過程中常出現諸多不良反應和并發癥，單獨使用尚不能使已損傷的脊髓結構重建和神經功能恢復。神經節苷脂雖然可提高患者膀胱和腸道功能［5］，但患者的生活質量或神經功能沒有從根本上得到改善，使得在臨床SCI治療中受到極大限制。

最近的臨床試驗結果提示在各種神經損傷的治療中，促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)可能是一種很有前途的神經保護劑，其具有抗凋亡、調制神經炎性反應、減輕水腫、促進神經元和少突膠質細胞存活，以及恢復血管完整性的功能(Fig 1)［6］。但是，長期或反復靜注EPO容易誘發紅細胞增多癥、高血壓以及血栓形成等多種血源性不良反應，甚至還會使機體產生中和性抗體，導致純紅細胞再生障礙性貧血［7］。這種劑量相關性毒副作用，嚴重的妨礙EPO作為SCI標準藥物的FDA認證。從這個意義上講，合成和開發具有內源活性、能透過血腦屏障的EPO變異體具有潛在的實際應用價值。根據已有的文獻報道，EPO變異體通常有衍生物、類似物和模擬肽3種形式［8］。本文擬從EPO變異體與SCI相關性的角度，根據神經保護機制的不同分別進行綜述，旨在為進一步開發新型EPO制劑提供科學依據。

Fig 1 Schematic of the relevance between erythropoietin variants and spinal cord injury

1 調節神經干細胞的增殖與分化，促進神經再生

針對原發性損傷，EPO能長期直接作用于神經干細胞，促進受損處神經再生。在實驗性自身免疫腦脊髓炎模型的研究中，rhEPO能夠通過增強少突膠質細胞增殖和髓鞘的形成，促進神經功能恢復。但是，由于EPO結構中富含糖基化，使肽鏈的穩定性增強，導致血液中的清除速率相對較慢。去唾液酸EPO(asialoEPO)作為一種去糖基化的EPO衍生物，可減少半衰期和阻止紅細胞慢性增生等不良反應。Erbayraktar等在大鼠SCI模型上證實，asialoEPO在體內可以生成一種半衰期很短，且有神經保護作用的生成物。Grasso等［9］也報道asialoEPO在體內的生成物，除了能明顯改善SCI大鼠的運動功能，還可將血漿半衰期從5～6 h縮短到不足2 min。

2 抑制神經細胞的凋亡

損傷后出現大量神經細胞的死亡不只是緣于直接損傷，還有繼發性損傷所致的細胞凋亡。通過對EPO抗凋亡機制的研究發現，EPO首先與EPOR結合生成二聚體激活JAK2磷酰化STAT-5，并活化PI3-K和NF-κB。活化的PI3-K則通過PIP3磷酸化使蛋白激酶B(AKT)激活，最終激活抗凋亡基因bcl-xL。PIP3通過AKT使BAD磷酸化而滅活，抑制了半胱天冬酶-1、3、9的激活而起到抗凋亡的作用。同時，活化的NF-κB從胞質入核直接與DNA作用，調節凋亡抑制基因的表達，從而整體上減少神經元的凋亡，促進神經元的發生。此外，磷酸化的STAT-5入核又可與DNA結合，促進抑制凋亡基因bcl-xL和bcl-2轉錄，Arishima等［10］報道 EPO能夠明顯降低神經元凋亡和caspase-3免疫反應細胞浸潤數量。Knabe等也在壓碎性的脊柱神經根損傷模型中發現，EPO能夠抑制背根神經節神經元的凋亡。

作為一種經過改造的EPO衍生物，氨甲基酰化EPO(carbamylated EPO，CEPO)長期大劑量使用不會引發血源性不良反應。它是由EPOR與一個βcR亞基通過異源二聚體介導發揮其神經保護作用，而不與造血細胞表面的受體結合。Leist等在SCI模型上證實，CEPO治療具有十分廣泛的治療時間窗，長期高劑量使用CEPO能夠明顯改善神經功能。King等［11］也報道CEPO治療大鼠SCI，可以減小病灶區域的面積和神經細胞的凋亡。另外，Lapchak等［12］報道通過對小鼠頸部脊髓搖擺的治療，CEPO明顯減少運動神經元的損失，從而促進運動功能恢復。

3 減輕興奮性氨基酸介導的細胞毒性

目前研究認為，在繼發性損傷中興奮性氨基酸(EAA)具有明顯的神經毒性作用。其作用機制主要有兩個方面:一方面，EAA大量釋放導致神經細胞的通透性改變，Na+、H2O內流致細胞毒性;另一方面，EAA的過度釋放可介導Ca2+大量內流，胞內Ca2+升高激活各種組織酶類，導致DNA、蛋白質和磷脂降解，生成具高度反應活性的氧自由基，破壞生物膜加重SCI。同時，EPO不僅能抑制谷氨酸、NMDA、紅藻氨酸等興奮性氨基酸介導的細胞毒性損傷，而且還能減少缺氧時谷氨酸的大量釋放。Yoo等［13］在體外培養脊髓神經元的研究中發現，EPO能夠保護神經元免受興奮毒性導致的神經突生長抑制EPOR表達明顯減少，進而減少了繼發性脊髓神經元損傷。Nagańska等［14］建立大鼠脊髓興奮性谷氨酸模型，EPO處理和加入谷氨酸受體阻斷劑都能夠抑制神經細胞壞死。另外，Brines等報道CEPO不僅可以阻止紅細胞增生，而且能抑制谷氨酸介導的細胞毒性。不僅如此，Pankratova等［15］還報道通過模擬rhEPO的C-螺旋區域氨基酸殘基(92-111)，設計并合成了一種名為Epotris的無造血活性的短肽。其不僅能促進小腦顆粒細胞軸突生長和減輕低鉀誘導的細胞毒性，而且能降低紅藻氨酸誘導的神經毒性致小鼠死亡率。

4 調制繼發性神經炎癥反應

EPO及其衍生物調制神經組織炎癥反應的機制主要是通過抑制促炎性因子TNF-α、IL-6及IL-8表達，增強抗炎性因子IL-10的表達以及調控以NF-κB族為主的炎癥基因表達，增強其抗炎作用。在體外試驗中，Yuan等［16］通過自身免疫性腦脊髓炎組織培養發現，EPO能夠抑制免疫反應特有的T細胞增殖以及T細胞生產的炎癥性細胞因子。Okutan等通過大鼠急性SCI模型證實，rhEPO治療其能明顯降低caspase-3和過氧化物酶的表達水平。另外Ning等［17］建立大鼠亞急性壓迫性頸椎SCI模型，rhEPO治療能夠增強脊髓運動功能。通過ELISA法檢測發現可以降低IL-8、TNF-α、IL-6的水平，減少炎癥反應的發生。Mennini等［18］也報道在小鼠脊髓側索硬化癥模型中，CEPO治療可以降低運動神經元損失，減少星形膠質細胞和小膠質細胞的激活。

5 抑制氧化反應

脊髓組織膜結構中含有豐富的脂質，損傷以后細胞線粒體氧化還原酶會發生脫偶聯反應，并不斷產生大量氧自由基，進而攻擊細胞膜上不飽和脂肪酸，誘發過氧化反應導致膜結構的破壞，致使細胞死亡。EPO及其衍生物能夠降低脂質過氧化，抑制氧自由基的產生，增加抗氧化酶的表達。脂質過氧化產物的增多會引發繼發性SCI。Kaptanoglu等報道EPO抑制脂質過氧化反應和對超微結構的神經保護作用均強于甲強龍。另外，Fu等［19］在硬膜外壓迫與腦血管夾閉的大鼠模型上證實，EPO治療可以明顯降低脂質過氧化產物水平，減弱大鼠脊髓氧化性損傷。Yazihan等［20］用EPO治療大鼠SCI，1 h后大鼠體內抗氧化酵素和過氧化氫酶活性增加，同時脂質過氧化產物水平降低。

6 對血管內皮細胞的作用，促進新血管生成

EPO及其衍生物不僅能夠通過結合血管內皮細胞上的EPO受體，調節血管內皮細胞的遷移和增生，從而刺激新血管的生成，而且能夠增加缺血區域的血流量，減輕缺氧引起的血管內皮損傷。EPO還可通過上調NO合酶的表達，舒張血管改善組織供血。Grasso等［21］報道在EPO治療大鼠SCI研究中，損傷區域神經元和血管內皮細胞EPO受體表達明顯增加。Ramirez等［22］報道CEPO既不能刺激內皮祖細胞的增殖，又不增加紅細胞生成。

7 促進微循環，增加缺血區血流量

SCI以后會導致體內多個器官的缺血，而缺血/再灌注也可導致中性粒細胞釋放過多，進而浸潤損傷區組織，加劇繼發性損傷。Cetin等［23］發現rhEPO能夠明顯減少急性SCI引起的局部缺血組織的損傷。S?nmez等［24］報道大鼠缺血/再灌注損傷之后，EPO治療能夠明顯增加脊髓前角運動神經元磷酸化cAMP反應元件結合蛋白的表達。Simon等［25］在主動脈栓塞導致豬脊髓缺血/再灌注損傷，EPO治療可減輕神經損傷和細胞凋亡。之后，Simon等又在豬主動脈栓塞4h后的脊髓缺血/再灌注損傷模型上證實，采用CEPO-FC融合蛋白治療能夠防止功能障礙和神經損傷，并且沒有血源性不良反應，具有更好的發展前景。

總而言之，EPO變異體通過減少半衰期、與受體上的不同位點結合、模擬活性中心等一系列修飾方法，不僅保留了原有的神經組織保護功能，而且消除了EPO治療帶來的血源性不良反應。故EPO變異體的開發日益受到神經藥物學家的廣泛重視。然而，脊髓繼發性損傷是多種因素的交互作用，機制錯綜復雜，發揮神經保護效應的信號轉導通路也受其它多種因子或受體因素的調控。因此，深入細致地探討EPO變異體與SCI的相關性，將會為臨床治療發現新的藥物靶標。

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