瘦素受體基因多態性與急性胰腺炎的相關性

郭繼文 李德強

瘦素(leptin)為肥胖(OB)基因的表達產物，是一種由167個氨基酸組成的分泌性蛋白質類激素，主要由脂肪細胞分泌。研究發現，瘦素與急性胰腺炎(AP)之間有密切關系，瘦素通過作用于瘦素受體(LEPR)而發揮作用。本研究運用多聚酶鏈反應一限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)技術檢測LEPR A668 g位點和G3057A位點基因多態性，探討LEPR基因多態性與AP的關系，為AP的防治提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本組患者46例，其中男27例，女19例，年齡18～75歲，平均53.7歲。其中胰管狹窄、胰管結石者11例，膽道感染及膽石癥23例，暴飲暴食者7例，不明原因者5例?；颊吲R床癥狀有不同程度的腹痛，呈絞痛、刀割樣痛或鈍痛;發熱23例，平均體溫為38.6℃;伴有不同程度腹脹、惡心、嘔吐者32例;并發低鉀血癥29例;重癥急性胰腺炎1例，有反跳痛及腹肌緊張表現，全腹有明顯壓痛，伴有血性腹水，可觸及明顯壓塊。所有患者均經B超、腹部平片、血淀粉酶檢查明確診斷。對照組45例為同期體檢科正常體檢者。兩組間一般情況比較見表1，兩組間TC、TG及血糖水平差異有統計學意義。

1.2 方法

1.2.1 LEPR基因檢測方法 ①DNA提取:取入組者外周血0.5 ml，2%EDTA抗凝，按Axygen試劑盒說明提取DNA。②LEPR 引物設計:參照文獻［1］:5'-ACCCTTTAAGCTGGGTGTCCCAATAG-3';5'-GCTAGCAAATATTTTTGTAAGCAATT-3”。③PCR 擴增:PCR 反應體系體積為 30 μl，2 μl DNA，2 mmol/L NTP 2 μl，引物 P1 40 pmol/L，引物 P2 40 pmol/L，10 × PCR 緩沖液3ul，2.5U Taq聚合酶。PCR反應條件:94℃預變性5 min，94℃ 50s，61℃ 60s，72℃ 90s，共 35 個循環。④RFLP 分析:A668 g、G3057A內切酶消化產物:取22 μl PCR產物，10×Buffer3 ul，H2O 1.5 μl，內切酶10U，37℃水浴過夜;取 20 ul酶切產物加入瓊脂糖凝膠負極端的加樣孔，以溴酚藍為指示劑，溴化乙錠為染色劑，在150伏電壓下電泳30 min，在300 mm紫外線燈下觀察帶型。A668 g位點共有3種基因型:GG為純合子突變型(300bp、140bp)，GA 為雜合子(440bp、300 bp、140bp)，AA為純合子野生型(440 bp);G3057A位點也有3種基因型:AA為純合子突變型(253bp)，GA為雜合子(253bp、221bp、32bp)，GG 為純合子野生型(32bp、221bp)。

1.2.2 統計學方法 應用統計SPSS 13.0軟件，基因型和等位基因頻率采用基因計數法，組間率的比較用R×C表χ2檢驗。

2 結果

2.1 LEPR基因多態性結果兩組間基因型GG、GA、AA的觀察值和期望值Hardy-Weinberg平衡吻合度良好(P＞0.05)，符合Hardy-Weinberg平衡定律，提示個體間無血緣關系。

2.2 兩組A668 g、G3057A基因型及等位基因分布頻率見表2。A668 g、G3057A基因型及A668 g等位基因頻率在AP組和對照組間差異無統計學意義;G3057A等位基因A在對照組的分布頻率低于AP組，差異有統計學意義。

2.3 LEPR基因型對血脂水平的影響LEPR A668 g位AG基因型攜帶者與GG基因型攜帶者血漿TG和TC水平差異無統計學意義。LEPR G3057A位不同基因型攜帶者的血漿血脂水平差異亦無統計學意義(均P＞0.05)，見表3。

表1 兩組間一般情況比較

表2 兩組A668G、G3057A基因型及等位基因分布頻率

表3 LEPR A668 g、G3057A基因型與血脂的關系(mmol/L)

3 討論

瘦素是肥胖基因編碼的脂源性激素，由脂肪細胞等合成后分泌入血，與特異的運輸蛋白結合，通過血腦屏障作用于下丘腦的瘦素受體，或直接作用于靶細胞的瘦素受體而發揮作用，其受體后機制是通過JAK-STAT信號轉導途徑實現的，主要活化JAK2-STAT3途徑，在特定基因啟動子區域發揮作用，調節靶基因轉錄［2，3］。瘦素具有廣泛的生物學效應，近年國外研究表明［4］，胰腺存在瘦素受體，瘦素與AP之間有密切關系，AP時炎癥誘導局部瘦素表達增高，給予外源性瘦素預處理胰腺組織瘦素受體表達亦升高。肥胖者AP預后差，可能與其存在的瘦素抵抗有關。給予外源性瘦素后的受體表達上調及受體激活可能緩解瘦素抵抗，從而保護肥胖癥AP患者的胰腺。AP時機體處于高度應激狀態［5］，體內應激激素分泌增加，如糖皮質激素、兒茶酚胺水平升高。糖皮質激素是瘦素分泌的強烈刺激物，誘導體循環瘦素水平升高，而升高的瘦素又對糖皮質激素起負反饋調節，可抑制應激激素的失控反應，因而瘦素可能具有改善AP預后的作用。由于瘦素必須通過與瘦素受體的結合才可以發揮其生理功能，因而許多學者推測瘦素受體基因的變異可能影響瘦素功能的發揮，并與血壓的變化有關。目前已在LEPR基因20個外顯子中發現了19種基因多態現象，但關于該基因變異與AP發病的關系報道結果不一。

本課題對瘦素受體基因Gln223Arg、PRO1019Pro多態性與AP的相關性進行了初步探討。Gln223Arg突變即基因編碼區第6外顯子668位核苷酸由A變異為G，使編碼第223位的谷氨酰胺(Gln)變為精氛酸(Arg);PRO1019pro為一沉默突變，基因編碼區第20外顯子3057位核苷酸由G變異為A，仍編碼脯氨酸(Pro)。

本組研究顯示AP組和對照組A668 g、G3057A基因型及A668 g等位基因頻率在AP組和對照組間差異無統計學意義;G3057A等位基因A在對照的分布頻率為8.89%，AP組14.13%，差異有統計學意義(χ2=6.544，P＜0.05)。從表3可以看出不同基因攜帶者在血脂水平差異上亦無統計學意義。

本研究結果提示AP與LEPR基因型頻率分布無明顯相關性，而G3057A等位基因A可能與AP的發病相關。由于遺傳機制比較復雜，一個基因多態性的表達是通過一個或一些與此多態性連鎖不平衡的其他的多態性的效應聯合發揮作用。并且AP的發生還受到地理條件、人的種族、生存環境等諸多因素的影響。目前有關AP與瘦素受體基因多態性關系的研究較為少見，這個基因變異是否與AP發病有密切的關系尚需大樣本、多地域、多民族廣泛深入的協同研究。

［1］ Kang SM，Kwon HM，Hong BK，et al.ExPression of lePtin reeePtor(Ob-R)in human atheroselerotic lesion:Potential role inintimal neovaseularization.Yonsei Medieal J，2000，41:68-72.

［2］ KitaA，Uotani S，Kuwahara H，et al.Vanadate enhances leptin-induced activation of JAK/STAT pathway in CHO cells.BiochemBiophysResCommun，2003，302:805-809.

［3］ Hegyi K，Fulop K，Kovacs K，et al.Leptin-induced signaltransduction pathways.CellBiol Int，2004，28:159-169.

［4］ Jaworek J，Bonior J，Konturek SJ，et al.Role of leptin in the controlof postprandial pancreatic enzyme secretion.J Physiol Pharmacol，2003，54:591-602.

［5］ Warzecha Z，DembinskiA，Ceranowicz P，et al.Influence of leptin administration on the course ofacute ischemic pancreatitis.J Physiol Pharmacol，2002，53(4 Pt2):775-790.