象草4CL基因片段的克隆及RNAi表達載體構建

霍松，陳慧，朱瓊華，解新明

（華南農業大學農學院，廣東 廣州510642）

象草（Pennisetumpurpureum）系禾本科（Gramineae）狼尾草屬多年生C4草本植物。由于它具有產量高、再生能力強、營養豐富、適口性良好、抗逆性強等優點，使之成為了熱帶、亞熱帶地區重要的資源植物。象草無論是作為能源植物，還是飼用植物及造紙原料，其品質與低木質素含量密切相關［1－4］。

RNAi（RNA interference）是指一些與靶基因序列同源的小片段干擾RNA，可高效和特異性地使mRNA降解，從而導致內源靶基因的沉默，最終產生相應功能的表型缺失現象［5，6］。4－香豆酸：CoA連接酶（4－coumarate：CoA ligase，4CL）是木質素合成中的一個關鍵酶，其位于苯丙烷類衍生物生物合成的關鍵點上，以肉桂酸及其羥基或甲氧基衍生物，如4－香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、5－羥基阿魏酸、芥子酸等為底物，生成相應的輔酶A酯。這些中間產物隨后進入苯丙烷類衍生物支路合成途徑。其中生成的香豆酰CoA、阿魏酰CoA及芥子酰CoA轉化為肉桂醇衍生物，后通過還原反應生成3種木質素單體［7，8］。目前已從多種植物中分離了編碼4CL的cDNA序列［9］。然而，針對禾本科植物的研究，僅有水稻（Oryzasativa）、玉米（Zeamays）和黑麥草（Loliumperenne）這3種植物［10－12］，同時在對4CL進行功能分析中，也未曾有人利用到RNAi技術。因此，利用RNAi技術開展對象草這種熱帶亞熱帶地區重要資源植物的4CL基因的研究，既具有重要的理論意義，又具有深遠的實踐意義。

目前有關植物RNAi載體的構建有多種方法［13］。常規方法構建RNAi載體需要使用限制性內切酶和連接酶，操作起來程序繁瑣，且連接效率較低。本實驗采用Gateway技術構建入門克隆，利用TOPO異構酶（topoisomerase）特性，能在5min內快速高效地將PCR（polymerase chain reaction）產物整合到Gateway入門載體上，徹底簡化了PCR產物進入Gateway入門載體的步驟。表達克隆的構建是利用LR反應將目的基因從入門載體重組轉入目的載體［14］。本試驗設計1對特異性引物，PCR擴增目的片段，利用Gateway技術，將目的片段導入目的載體，形成具有ihpRNA結構的高效表達載體，并將其轉入農桿菌EHA105中。為下一階段通過轉基因技術開展象草遺傳改良，培育新型象草種質資源奠定重要的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究在2010年進行。實驗所用材料為華南象草（P.purpureumcv.Huanan），種植于華南農業大學寧西實驗基地和校內躍進南牧草引種園。入門載體pCR?／GW／TOPO?vector購自Invitrogen公司；目的載體pCB2004B由中國科技大學向成斌教授實驗室惠贈。大腸桿菌（Escherichiacoli）DH5α和根癌農桿菌（Agrobac－teriumtumefaciens）EHA105為華南農業大學農學院草生物技術實驗室保存菌種。TRIzol Kit、pCR?／GW／TOPO?TA Cloning?Kit、Gateway LR reaction Kit，PurelinkTMQuick Plasmid Miniprei Kit均購自于Invitrogen公司；TaKaRa Ex Taq聚合酶、DNA回收試劑盒，購自于TaKaRa公司。其他試劑均為國產或進口分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 目的片段的選擇及引物設計 根據本課題組從摩特矮象草中分離的4CL基因序列（登錄號：GU997597.1），與其他4種4CL基因［玉米、柳枝稷（Panicumvirgatum）、多年生黑麥草、水稻］做同源性比較，選擇同源性較高的部分，利用Primer 3（version 0.4.0）設計 PCR引物4CL－L（5′－AGCCGTTCCAGGTGAAGTC－3′）和4CL－R（5′－GGCGAGATCATCCTTCTCTG－3′）；同時在pCB2004B插入目的片段的兩端設計2對引物，04B－L1（5′－AT CACAAAGTGCCCATCACA－3′）和 04B－R1（5′－CTGGCGTAATAGCGAAGAGG－3′）、04B－L2（5′－GCGCGC TATATTTTGTTT－3′）和04B－R2（5′－CAGGGTTTTC CCAGTCAC－3′），用于檢測目的片段是否正確插入。所有引物均由Invitrogen有限公司合成。

1.2.2 目的片段的擴增 采用Trizol提取法從象草的幼嫩莖中提取總RNA，各步驟均按試劑說明書進行。用瓊脂糖電泳和紫外分光光度計檢測其質量，用高質量的RNA做下一步實驗。按照反轉錄試劑盒提供的程序合成cDNA第一鏈。以該cDNA 20倍稀釋液為模板，采用50μL擴增體系：1μL反轉錄cDNA、5μL 10×PCR Buffer、4μL 2.5μmol／L dNTP、0.5μL 5U／μL TaKaRa Ex Taq?、10μmol／L 4CL－L和4CL－R各2μL，加入經焦炭酸二乙酯處理過的超純水至總體積50μL。PCR反應條件：95℃預變性5min、95℃變性30s、55℃退火30 s、72℃延伸90s，35個循環后，于72℃延伸7min。PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，并用試劑盒回收目標條帶。

1.2.3 Gateway入門克隆的構建 在0.5mL eppendorf管中，加入回收的目的片段2μL（約60ng），Salt Solution 1μL，TOPO vector 1μL，用滅菌超純水補至6μL體系，23℃連接5min，將目的片段定向克隆到pCR?／GW／TOPO?載體中，形成入門克隆載體pENTR－4CL。具體操作方法依據pCR?／GW／TOPO?試劑盒說明書進行。入門載體pENTR－4CL用熱激法轉化至大腸桿菌Mach1TM－T1?感受態細胞中。將轉化細胞均勻涂在含壯觀霉素（100mg／L）LB（Luria－Bertani）固體培養基上，37℃培養5h，挑取單克隆到含有相同壯觀霉素的LB液體培養基，再振蕩培養5h。之后以4CL－L和4CL－R為引物，菌液為模板，PCR驗證陽性克隆。最后選取陽性克隆的菌液，送華大基因公司測序。測序引物為 M13通用引物（M13－L：5′－GTAAAACGACGGCCAG－3′，M13－R：5′－CAGGAAACAGCTATGAC－3′）。用試劑盒提取入門載體質粒，方法參照試劑盒說明書進行，為表達克隆的構建做準備。

1.2.4 Gateway表達克隆的構建 LR反應采用10μL體系：在0.5mL的eppendorf中加入pENTR－4CL3μL（約150ng），pCB2004B5μL（約250ng），LR ClonaseⅡ2μL，25℃反應15h。加1μL蛋白酶 K，37℃反應10 min，以終止反應。片段克隆到pCB2004B載體中，形成表達克隆載體pCB2004B－4CL。取5μL反應液熱激法轉入大腸桿菌DH5α感受態細胞，將轉化細胞均勻涂在含卡那霉素（50mg／L）LB瓊脂培養基上，37℃培養14h，挑取單克隆到含有相同卡那霉素的LB液體培養基再振蕩培養14h。以4CL－L和4CL－R，04B－L1和04B－R1，04BL2和04B－R2等3對引物作菌液PCR，鑒定陽性克隆。最后把陽性克隆菌液，送華大基因公司測序。測序引物為04B－L1和04B－R1，04B－L2和04B－R2。

1.2.5 農桿菌表達克隆的構建 將測序驗證正確的陽性克隆載體pCB2004B－4CL，用凍融法轉至農桿菌EHA105，以特異性引物4CL－L和4CL－R，04B－L1和04B－R1，04B－L2和04B－R2進行PCR擴增驗證陽性菌落，同時以未轉化的農桿菌EHA105做陰性對照。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。

2 結果與分析

2.1 目的片段的獲得與驗證

用引物4CL－L和4CL－R，以經反轉錄所得cDNA為模板進行PCR擴增，擴增產物用1.0%的瓊脂糖電泳檢測，和預期結果一致，長度大約為374bp（圖1）。經進一步測序，得到如下序列：5′－AGCCGTTCCAGGTGAAG TCCGGGTCGTGCGGCACGGTGGTGCGGAACGCGGAGCTCAAGATCGTCGACCCCGACACCGGCGCCGC CCTCGGCCGGAACCAGCCCGGCGAGATCTGCATCCGCGGGGAGCAGATCGTGAAAGGGTACCTGAAC GACCCCGAGTCGACCAAGAACACCATCGACAAGGACGGGTGGCTGCACACCGGGGACATTGGTTACG TCGACGACGACGACGAGATCTTCATCGTCGACAGGCTCAAGGAGATCATCAAGTACAAGGGCTTCCA GGTGCCGCCGGCCGAGCTCGAGGCGCTCCTCATCACGCACCCGGAGATCAAGGACGCCGCCGTCGTCT CAGAGAAGGATGATCTCGCC－3′。該片段和摩特矮象草4CL基因的同源性為98%，證明為華南象草的4CL基因片段。

2.2 入門載體的陽性克隆檢測

將目的片段經TOPO克隆后，可形成pENTR－4CL入門載體。pENTR－4CL載體轉入大腸桿菌后，經搖菌培養獲得菌液，以4CL－L和4CL－R為引物，對其進行PCR擴增，所得片段大小接近374bp（圖2），證明目的片段已成功連入載體。為了更進一步驗證克隆的準確性，筆者還以M13通用引物進行測序，測序結果和目的片段比對，同源性為100%，證明入門克隆構建成功。

圖1 電泳檢測PCR擴增片段Fig.1 Detection of PCR amplification fragments

圖2 電泳檢測TOPO反應陽性克隆Fig.2 Detection of positive clones from TOPO reaction by agarose gel electrophoresis

2.3 表達載體的陽性克隆檢測

經LR反應，將pENTR－4CL入門載體上的4CL目的片段轉移到目的載體pCB2004B上，進而形成pCB2004B－4CL表達載體。

為了驗證目的片段（RNA干涉片段）是否同時正確插入到表達載體的2個位點上，分別以04B－L1和04BR1，04B－L2和04B－R2這2對引物對表達載體pCB2004B－4CL的克隆產物進行了PCR驗證。由表達載體pCB2004B－4CL上引物的位置可知，這2對引物擴增的目的片段長度應分別為548和772bp。使用這2對引物及目的片段上的4CL－L和4CL－R引物對3個克隆進行了PCR驗證。電泳結果表明，挑取的3個克隆均為陽性（圖3）。進一步測序，與目的片段比對，同源性為100%，證明表達克隆構建成功。

2.4 轉化農桿菌及其驗證

農桿菌是一種天然的植物遺傳轉化體系，被譽為“自然界最小的遺傳工程師”，農桿菌介導法具有簡便、高效、低拷貝數等特點［15］。借助農桿菌的感染可實現外源基因向植物細胞的轉移和整合，然后通過細胞和組織培養技術，得到轉基因植物。本研究也試圖通過農桿菌將RNA干涉片段導入象草中。因此，將pCB2004B－4CL表達載體轉入農桿菌是構建RNAi表達載體的關鍵一步。本實驗通過凍融法將pCB2004B－4CL轉入農桿菌，并以4CLL和4CL－R，04B－L1和04B－R1，04B－L2和04B－R2等3對引物對已轉化的EHA105菌液進行PCR擴增，檢測其是否含有表達載體。電泳結果表明，所挑取的2個克隆，均為陽性克隆（圖4，泳道1～6），同時以未轉化EHA105菌液做陰性對照，無條帶出現（圖4，泳道7～9）。

圖3 電泳檢測LR反應陽性克隆Fig.3 Detection of positive clones from LR reaction by agarose gel electrophoresis

圖4 電泳檢測EHA105陽性菌液Fig.4 Detection of positive bacteria liquid of EHA105 by agarose gel electrophoresis

3 討論

3.1 RNA干涉片段的大小選擇

根據siRNA作用機制［16，17］，siRNA途徑是由雙鏈RNA（dsRNA）引起的序列特異性基因沉默，dsRNA被內切核酸酶（Dicer）切割成21～23nt長的siRNA，此siRNA指導形成RISC蛋白復合物降解與之序列互補的mRNA，從而引發RNA沉默。目前，在植物中根據不同的實驗情況及不同的dsRNA來源，主要有2種介導方法引發RNAi機制：其一是發夾式RNA（hairpin RNA，hpRNA）介導的基因沉默，其二是病毒介導的基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）。由于VIGS不能穩定遺傳，在植物基因功能鑒定中的應用有所局限。因此構建hpRNA高效克隆和表達載體，并用于植物特定基因功能鑒定及表達調控是RNAi技術的研究熱點。RNA干涉載體以含有2個反向重復序列，中間夾1個內含子所形成ihpRNA（intron－hairpin RNA）結構的沉默效果最好，平均比例高達90%以上［16］。關于發夾結構RNAi高效表達載體發夾結構臂序列的選擇，以往研究認為序列長度具有一定的可塑性，在100～1 200bp均能取得良好的效果［18，19］。根據以往的經驗，片段太短不利于實現高效率的RNA干涉；而太長的片段在構建中容易引起與宿主菌重組，且太長的dsRNA結構上不太穩定，一般認為所選片段的大小在300～600bp最佳［16，18］。因此，本研究中選用了374bp的長度。選擇片段時，盡量選擇在本基因中保守，且與其他基因無同源性的區域作為RNAi片段，和其他基因序列連續相同的堿基數不超過20，以避免把其他非目標基因沉默［20］。筆者認為，如果所研究物種的公開基因序列很少，可以將所用目的片段的序列與其他親緣關系較近物種的全基因組進行比較，例如本研究就是通過與水稻的基因組進行比較，從而做出預判的。

華南象草的目的片段和摩特矮象草的同源性為98%，說明二者在4CL基因序列上是存在差異的。從木質素含量上來看［21］，拔節后，華南象草無論是莖稈還是葉片的木質素含量均高于摩特矮象草；從4CL酶活性來看，在不同發育階段，在這2個品種間也存在某種差異［3］。因此，在4CL基因片段上存在一定差異也就可以理解了，或許這正是上述差異的分子基礎。

3.2 Gateway系統的優勢

本研究利用Gateway系統將目標基因的PCR產物直接插入到載體中，形成高效沉默系統。傳統的以酶切連接為基礎的植物RNAi表達載體構建方法耗時費力、實驗周期長；以重組PCR技術為基礎結合酶切連接的植物RNAi表達載體構建方法，也由于目的片段的選擇和內引物的設計受到的限制因素較多，使其應用受到了一定影響［13］。筆者采用的方法省去了酶切和連接的繁瑣步驟，并將目的片段的PCR產物直接進行TOPO克隆，在完成目的片段克隆的同時也完成了入門克隆的構建，省去BP反應過程，而且可以快速的應用到其他帶有attR接頭位點的表達載體。

3.3 測序的重要性

在入門克隆的構建過程中，有可能連接上和目的片段大小大約一致的PCR產物，僅以目的片段的引物做菌液PCR，或者以載體引物做菌液PCR驗證，均不能保證其PCR產物一定為目的片段，可能出現假陽性克隆，在實驗中會偶然出現類似情況，因此有必要進行測序驗證。構建表達克隆所用的入門克隆載體，一定要用測序正確的菌液進行提取，不能隨便更換為其他PCR驗證正確的菌液。在載體上目的片段的兩端設計引物，既方便菌液PCR驗證，也可以用于測序。植物基因工程中，外源基因表達量不足是得不到理想的轉基因植物的主要原因之一［22］，RNAi具有高度的特異性，如果有1個堿基與靶序列錯配，其干擾效應可能將大大減弱［18］，因此任何一步的轉接都有必要做測序驗證。

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