一年生黑麥草制取燃料酒精發酵工藝的初步研究

代，郭和蓉，張興龍，李強

（華南農業大學農學院，廣東 廣州510642）

目前國內外生產燃料酒精的原料主要有玉米（Zeamays）（美國）［1］、甘蔗（Saccharumofficinarum）（巴西）［2］、薯類、谷類等，考慮到糧食短缺、人口壓力等問題，尋找一種新的燃料酒精的生產底物勢在必行。纖維質原料具有來源廣泛、成本低廉、可再生等優點［3］，因此被看作是最具價值的生產燃料酒精的潛在資源，以將纖維素為原料轉化為燃料酒精最具現實意義。在纖維素燃料酒精轉化的生產和研究方面，巴西和美國走在了世界的前列［4］。巴西開發了以甘蔗渣為原料制酒精的新技術（迪丁尼快速水解法，DHR），減少水解蔗渣的時間而獲得高的轉化率［5］；美國也進行了“纖維素水解與發酵同步”及木質纖維素“溶解性分離”等一系列研究工作［6］，但以纖維素制乙醇的工業規模技術一直未達到成熟［7］。此外，加拿大Iogen公司在纖維乙醇技術開發，尤其是纖維素酶技術開發方面居世界領先地位［8］；德國產業技術綜合研究所進行發酵液中乙醇的膜分離技術的開發；日本也建立了較完善的與纖維素燃料乙醇相關的研發體系［5］。

我國在纖維素酒精生產和技術開發上也取得了一些重要進展。中糧集團在黑龍江肇東建立了年產500t的纖維素乙醇中試裝置，并已經擁有36項燃料酒精方面的專利，其中，與纖維素酒精相關的有14項；2008年5月8日，河南天冠集團研制建成了中國首條年產5 000t纖維酒精項目產業化生產線，并且順利產出了第一批纖維酒精［6］。中國科學院過程工程所已在山東建立了年產3 000t的纖維乙醇示范工程；吉林燃料乙醇有限公司已和華東理工大學就建立年產3 000t纖維乙醇的合作達成協議，并啟動了項目實施［8］。除此之外，我國也進行了“利用農業纖維廢棄物代替糧食生產酒精”，玉米秸稈間歇蒸汽爆破預處理、纖維素酶水解和戊糖己糖同步發酵技術制取纖維乙醇中試裝置等一系列研究工作［6］。

一年生黑麥草（Loliummultiflorum）是禾本科黑麥草屬植物，生長速度快，產量高［9］，易種植，好管理［10］，是我國南方廣泛栽培的優良牧草［11］。目前，可作為能源植物發展的植物種類豐富，如甘蔗［12］渣、麥（Triticumaestivum）稈［13］、柳枝稷（Panicumvirgatum）［14，15］等。它們的木質素含量［16－18］均比一年生黑麥草高，而它們的纖維素和半纖維素含量［16－18］與一年生黑麥草卻有著極大的相似性。另外，一年生黑麥草纖維構成適合于酒精的轉化，所以具有較大的研究和開發價值。有研究表明黑麥草已經被應用到發酵等工業領域，將其經過預處理及纖維素、半纖維素酶解后，對探索生物酒精的制備有重要意義［19］。本試驗采用2種發酵方案，研究利用一年生黑麥草發酵處理制取酒精，通過對影響因素的優化，得出最佳發酵體系，為再生能源的開發尋找到一條新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2008－2009年在華南農業大學農學院進行，以分別經過酸預處理［在溫度120℃條件下，粒度18～35目（0.425～0.880mm）的邦德以8∶1液固比經1%H2SO4處理2h］和堿預處理［在溫度100℃條件下，粒度18～35目（0.425～0.880mm）的邦德以6∶1液固比經10%NaOH 處理2h］，再用綠色木酶（Trichoderma viride）酶解72h后的一年生黑麥草邦德（L.multiflorumcv.Abundant）為材料。

1.2 發酵單因素試驗

經過酶解后的酸堿預處理材料在發酵階段主要采取2種方案，酵母組合均為普通釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，產品代碼CICC1001）＋畢赤酵母（Pichiapastoris）。方案1：預處理材料＋酵母組合，體積比約為7∶3；方案2：預處理材料＋酵母組合＋黑曲霉（Aspergullusniger，產品代碼AS 3.877），體積比約為7∶3∶2。所有微生物均由廣州微生物所提供。發酵處理的具體方法見表1，試驗設3次重復，測定指標為酒精度、原料酒精轉化率。

1.3 發酵正交試驗

為進一步優化發酵的工藝條件和研究各因素對發酵影響的主次順序，采用正交試驗研究了發酵溫度、時間和菌株濃度對預處理的影響，其中酸堿預處理的pH均是5.5，其余各因素水平是在單因素試驗基礎上選定的，測定指標及試驗重復次數同單因素試驗，試驗條件見表2。

1.4 發酵方法

將酸堿預處理＋酶解后的材料放在250mL三角瓶中進行發酵試驗，每瓶裝酸（堿）預處理液體（中和后，全部加入）、（NH4）HPO4（0.25g／L）、MgSO4·7H2O（0.025g／L）共100mL。滅菌后置恒溫振蕩培養箱內振蕩培養，控制溫度31～43℃。按發酵液體積的8%～14%接種菌株。

表1 酸堿預處理材料酶解后的發酵單因素試驗Table 1 Range of factors in fermentation single－factor test based on pretreatment with H2SO4（NaOH）and enzymatic hydrolysis

表2 硫酸（氫氧化鈉）預處理材料酶解后的發酵正交試驗Table 2 Range of factors in fermentation orthogonal test based on pretreatment with H2SO4（NaOH）and enzymatic hydrolysis

1.5 測定指標

1.5.1 酒精度 發酵結束后將發酵液置于蒸餾瓶中，緩緩加熱蒸餾，收集約96mL餾出液，定容至100mL容量瓶，調溫至20℃。用25mL附溫度計密度瓶測試樣餾出液20℃的相對密度，附溫度計比重瓶（整套）先用蒸餾水清洗干凈，再用乙醇、乙醚清洗干凈，稱得自重，計G1；蒸餾水煮沸30min冷卻至15℃注滿瓶中，裝上溫度計（注意排空瓶中氣體），浸入（20±1）℃的恒溫水浴鍋中，至比重瓶溫度穩定到20～30℃，用濾紙吸去側管之水，蓋上小罩，取出擦干，稱得瓶（整套）和水之重，計G3；重復上一步驟測定待測液體，稱得瓶（整套）和待測液之重，計G2；酒精相對密度（20℃）計算公式：Y＝（G2－G1）×0.998 23／（G3－G1），根據相對密度查表，得到試樣的酒精度（Q）。酒精相對密度見文獻［20］。

1.5.2 原料酒精轉化率 原料酒精轉化率計算公式

式中，y表示原材料酒精轉化率（%，w／w），Q表示酒精度（%，V／V），V（mL）是蒸餾液體積，0.8（g／mL）是酒精密度，25.00（g）表示原材料質量。

1.6 數據處理和統計分析

采用SAS 8.1和Excel 2003進行試驗數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 發酵溫度的影響

2種發酵處理的酒精度隨著溫度的升高均呈現出先增加后減少的趨勢（圖1）。酸預處理＋酶解和堿預處理＋酶解材料的2種發酵處理的酒精度均在37℃時達到最大值，分別為2.3%，2.5%和2.1%，2.5%。酵母組合＋黑曲霉處理的酒精度略高于酵母組合處理，差異不顯著，說明黑曲霉起到了同步降解纖維素的作用。37℃是比較理想的發酵溫度。

2.2 發酵時間的影響

2種發酵處理的酒精度隨著發酵時間的延長均呈現出先增加后基本保持不變的趨勢（圖2）。當發酵時間在36h左右時，酸預處理＋酶解材料的2種發酵處理的酒精度比較接近，而堿預處理＋酶解材料的2種發酵處理的酒精度卻相差較大，但二者差值卻相對恒定，表現為隨著發酵時間的延長，絕對差值變幅不大。酸預處理＋酶解和堿預處理＋酶解材料的2種發酵處理的酒精度分別在36～48和48～60h時達到最大值，分別為2.3%，2.5%和2.1%，2.4%。酵母組合＋黑曲霉處理的酒精度略高于酵母組合處理，差異不顯著。結合發酵數據發現，發酵時間超過48h后，酒精度的增加幅度接近于0或者出現負增長，這可能與微生物自身消耗有一定的關系，綜合考慮認為48h是相對最優的發酵時間。

圖1 不同發酵溫度下的酒精度比較Fig.1 Comparison of the alcohol content at different fermentation temperatures

圖2 不同發酵時間下的酒精度比較Fig.2 Comparison of the alcohol content at different fermentation time

2.3 發酵液pH值的影響

2種發酵處理的酒精度隨著pH的升高均呈現出先增加后減少的趨勢（圖3）。酸預處理＋酶解材料的2種發酵處理的酒精度范圍分別是1.4%～2.3%和1.5%～2.5%，堿預處理＋酶解材料的2種發酵處理的酒精度范圍分別是1.4%～2.1%和1.6%～2.5%，且均在pH為5.5時達到最大值，酵母組合＋黑曲霉處理的酒精度略高于酵母組合處理，差異不顯著。

2.4 菌株濃度的影響

2種發酵處理的酒精度隨著菌株濃度的升高均呈現出先增加后減少的趨勢（圖4）。酵母組合＋黑曲霉處理的酒精度高于酵母組合處理，說明黑曲霉起到了同步降解纖維素的作用。

在不同菌株濃度下，酵母組合處理的酒精度范圍分別是1.9%～2.3%和1.7%～2.3%，酵母組合＋黑曲霉處理的酒精度范圍分別是2.1%～2.5%和2.1%～2.3%。兩種發酵處理的酒精度在菌株濃度分別為10%、12%時達到最大值。

圖3 不同pH值下的酒精度比較Fig.3 Comparison of the alcohol content at different pH values

圖4 不同菌株濃度下的酒精度比較Fig.4 Comparison of the alcohol content at different concentrations of strains

2.5 發酵正交試驗分析

2.5.1 原料酒精轉化率變化趨勢 2種發酵方案的原料酒精轉化率隨著溫度的升高均表現出先升高后降低的趨勢（圖5，6），隨著發酵時間的延長，原料酒精轉化率表現出先有所增加后維持穩定的趨勢，當發酵時間超過48 h以后，原料酒精轉化率變化幅度不大，時間過長還會導致原料酒精轉化率出現負增長。

酸（堿）預處理＋酶解后的材料在發酵階段，隨著菌株濃度的增加呈拋物線形狀（圖7），即在菌株濃度達到一定程度時，菌株濃度的增加會降低原料酒精轉化率，這與微生物自身的消耗有關。隨著發酵溫度的增加、發酵時間的延長、菌株濃度的增加，原料酒精轉化率均呈先增加后降低的趨勢。

由圖5～7可以得出合適的發酵溫度、適中的發酵時間與適宜的菌株濃度均有利于原料酒精轉化率的提高，與單因素試驗結果一致。

2.5.2 正交試驗結果與極差分析 酸預處理＋酶解＋酵母組合的酒精度與原料酒精轉化率影響因素主次順序相同（表3，4），均為菌株濃度＞發酵溫度＞發酵時間；酸（堿）預處理＋酶解＋酵母組合＋黑曲霉和堿預處理＋酶解＋酵母組合3種處理方式的酒精度與原料酒精轉化率影響因素主次順序均相同，均為發酵溫度＞菌株濃度＞發酵時間。

酸預處理＋酶解＋酵母組合正交試驗的最優水平組合相同，均為D2E2F2，即發酵溫度37℃，菌株濃度10%，發酵時間48h；酸預處理＋酶解＋酵母組合＋黑曲霉正交試驗的最優水平組合相同，均為D2E3F1，即溫度37℃，菌株濃度14%，發酵時間36h（表4）。整體上對于酸預處理＋酶解的材料而言，2種發酵方案的相對最優發酵溫度均為37℃，但相對最優菌株濃度和發酵時間均不一致。結合單因素試驗和極差值可以得出，隨著菌株濃度的提高，原料酒精轉化率的提高幅度不明顯，但至于是否會縮短發酵時間還有待于進一步驗證。綜合考慮認為菌株濃度12%，發酵時間48h是相對最優的選擇。

圖5 原料酒精轉化率隨溫度提高的變化趨勢Fig.5 The trend of alcohol conversion rate of raw materials with the temperature increase

圖6 原料酒精轉化率隨發酵時間延長的變化趨勢Fig.6 The trend of alcohol conversion rate of raw materials with the extension of fermentation time

圖7 原料酒精轉化率隨菌株濃度增加的變化趨勢Fig.7 The trend of alcohol conversion rate of raw materials with the concentrations of strains increase

表3 酸堿預處理邦德酶解后發酵的正交試驗結果Table 3 Results of the fermentation orthogonal design on Abundant based on pretreatment with H2SO4（NaOH）and enzymatic hydrolysis%

表4 酸堿預處理邦德酶解后發酵的正交試驗極差分析Table 4 The range analysis method of the fermentation orthogonal experiment on Abundant based on pretreatment with H2SO4（NaOH）and enzymatic hydrolysis

堿預處理＋酶解＋酵母組合正交試驗的最優水平組合分別為D2E2F2和D2E2F3，即相對最優發酵溫度和菌株濃度均一致，分別為37℃和10%，相對最優發酵時間不一致。堿預處理＋酶解＋酵母組合＋黑曲霉正交試驗的最優水平組合分別為D2E2F2和D2E2F3，即相對最優溫度和菌株濃度均一致，分別為37℃和12%，相對最優發酵時間不一致。結合單因素試驗和極差值可以得出，發酵時間在超過48h后，原料酒精轉化率變化幅度不大，時間過長還會導致原料酒精轉化率出現負增長。整體上對于堿預處理＋酶解的材料而言，2種發酵方案的相對最優發酵溫度均為37℃，相對最優菌株濃度分別為10%和12%，相對最優發酵時間均為48h。

3 討論與結論

本試驗主要針對普通酵母、畢赤酵母、黑曲霉進行了一些探索。通過預處理后，方案1（普通酵母＋畢赤酵母，體積比7∶3）的相對最優發酵條件為：溫度37℃，菌株濃度10%，pH 5.5，時間48h。在此條件下，酸堿預處理＋酶解后發酵的酒精度分別為2.2%和2.1%。方案2（普通酵母＋畢赤酵母＋黑曲霉，體積比7∶3∶2）的相對最優發酵條件為：溫度37℃，菌株濃度12%，pH 5.5，時間48h。在此條件下，酸堿預處理＋酶解后發酵的酒精度分別為2.3%和2.5%。

酸堿預處理＋酶解后的材料采用發酵方案2的原料酒精轉化率相對較高，分別為8.36%和8.39%。2種方案的原料酒精轉化率隨著發酵溫度的增加、發酵時間的延長、菌株濃度的增加，均呈先增加后降低的趨勢。綜合分析可以得出，2種處理方式的酒精度均為2.2%左右，原料酒精轉化率均約8.0%，差異不顯著，和安宏［21］的纖維素發酵結果13.6%、李文亮等［22］的甜高粱（Sorghumvulgare）發酵結果14.2%相比，轉化率相對較低，說明要在后續研究中深入分析酸堿預處理的特點及預處理后的物質組成，進而為發酵菌種的馴化和選擇奠定基礎。另外，本試驗是在搖瓶條件下進行的，在種子液培養過程中，菌種接入較大，所以實際酒精轉化率可能要略小于上述值，離工業應用要求還有很大的差距，還需要進一步的探索研究。

［1］黃宇彤，杜連祥，趙繼湘.世界燃料酒精生產形勢［J］.釀酒，2001，28（5）：24－26.

［2］廖興華，夏延斌，周傳云.燃料酒精的發展現狀和研究趨勢［J］.釀酒，2007，34（5）：18－20.

［3］王麗，陳衛平.纖維質原料制燃料酒精的研究進展［J］.釀酒科技，2005，（3）：57－60.

［4］趙秦，劉敏.纖維素原料制備燃料酒精發酵工藝探討［J］.釀酒，2008，35（3）：50－52.

［5］羅菊香，梁一池，林武滔，等.纖維素原料生產燃料酒精的技術現狀和研究趨勢［J］.三明學院學報，2008，25（4）：442－446.

［6］商成祥.國內外纖維素燃料生物汽油發展綜述［J］.化學工程與裝備，2009，（11）：131－132.

［7］梁鮮香.木質纖維素制備燃料乙醇的研究［D］.北京：北京化工大學，2009.

［8］柳羽豐，王濱生，王佳祥.非糧燃料乙醇發展綜述［J］.化學工程師，2009，（7）：53－55.

［9］季楊，張新全，馬嘯，等.多花黑麥草品種（系）間雜交及其雜種后代SRAP遺傳分析［J］.草業學報，2009，18（4）：260－265.

［10］盧敏，左相兵，熊先勤.一年生黑麥草在貴州獨山的引種品比試驗［J］.草業與畜牧，2007，（3）：24－25.

［11］李元華，張新躍，宿正偉，等.多花黑麥草飼養肉兔效果研究［J］.草業科學，2007，24（11）：70－72.

［12］于輝，向佐湘，楊知建.草本能源植物資源的開發與利用［J］.草業科學，2008，25（12）：46－50.

［13］陳玉亮.利用麥稈糖化發酵乙醇的初步研究［D］.楊凌：西北農林科技大學，2009.

［14］程序.能源牧草堪當未來生物能源之大任［J］.草業學報，2008，17（3）：1－5.

［15］劉吉利，朱萬斌，謝光輝，等.能源作物柳枝稷研究進展［J］.草業學報，2009，18（3）：232－240.

［16］Wiselogel A，Tyson S，Johnson D.Biomass Feedstock Resources and Composition［M］.Hand－book on Biotenchnol：Production and Utilization，1996：105－118.

［17］Belayachi L，Delmas M.Sweet sorghum bagasse：A raw material for the production of chemical paper pulp：Effect of depithing［J］.Industrial Crops and Products，1997，6（3－4）：229－232.

［18］Demirbas A.Aqueous glycerol delignification of wood chips and ground wood［J］.Bioresource Technology，1998，63（2）：179－185.

［19］Liu C F，Xu F，Sun J X.Physicochemical characterization of cellulose from perennial ryegrass leaves（Loliumperenne）［J］.Carbohydrate Research，2006，34（1）：2677－2687.

［20］國家藥典委員會.中國藥典［M］.北京：化學工業出版社，2000.

［21］安宏.纖維素稀酸水解制取燃料酒精的試驗研究［D］.杭州：浙江大學，2005.

［22］李文亮，邊鳴鏑，王海波.甜高粱秸稈發酵生產乙醇的研究［J］.江西農業學報，2010，22（3）：158－160.