桑仙降壓顆粒對自發性高血壓大鼠心肌微血管密度及血管抑素蛋白密度的干預1）

張蘊慧

中醫藥在治療高血壓方面具有整體性、多途徑、多層次、副反應優勢，本著為治療高血壓及預防靶器官損害開辟新途徑的原則，從微血管增殖因子入手，研究桑仙降壓顆粒對自發性高血壓大鼠（SHR）心肌微血管密度（MVD）和內皮抑素（ES）的干預，并深入分析其作用機制。

1 材料與方法

1材料

1.1 動物與分組 4周齡SHR，雌雄各半，體重200g～240g，由中國醫學科學院阜外心血管醫院提供（醫動字第01－108號）。4周齡 Wistar大鼠，雌雄各半，體重210g～250g，由山東醫科大學動物室提供［動物合格證號：SCXK（魯）20090001］。以A標示正常對照組即 Wistar大鼠組；B、C、D分別標示SHR不同的給藥方式，B組，SHR給予蒸餾水為空白對照組；C組，SHR給予桑仙降壓顆粒為實驗組，D組，SHR給予吲噠帕胺為西藥對照組；觀測事項點：0組的觀測時間為 Wistar大鼠、SHR4周齡；1、2的觀測時間為 Wistar大鼠、SHR給藥后4周、8周。根據不同觀測時間隨機分組，A組分為A0、A1、A2，B0、B1、B2，C1、C2，D1、D2。

1.2 藥物 桑仙降壓顆粒組方有桑寄生、淫羊藿、丹參、川芎等，由山東中醫藥大學中藥制劑室按正交試驗法優選工藝制成，每克含生藥6g，臨用前加蒸餾水稀釋成含生藥0.8g／mL的藥液。吲噠帕胺片每粒2.5mg，由天津力生制藥股份有限公司提供制備成混懸液。

1.3 試劑 Anti－ESM1，美國Santa cruz公司產品；CD34抗體為北京博奧森生物技術有限公司產品；生物素化山羊抗兔IgG，鏈霉親和素2生物素（SABC）和DAB顯色劑均由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.4 實驗儀器 METTLER AE20型電子分析天平，海特勒托利多上海儀器有限公司提供；康樂電熱恒溫水浴槽，上海醫療器件七廠提供 ；光學顯微鏡，由山東省中醫院病理科提供。

1.5 制備 用戊巴比妥鈉（40mg／kg）體重腹腔注射，麻醉后立即經腹主動脈注入4℃生理鹽水，切開下腔靜脈放血，待沖洗液干凈無色后，立即開胸，快速分離，摘取心臟，置入4℃生理鹽水中快速沖洗3次。

1.6 CD34標記MVD 采用免疫組化SP法。參照AXIOTIS等［1］的標準，由兩位病理醫生采用盲法（獨立檢測）在高倍鏡（×400）下讀片。每張切片高倍鏡下隨機選取10個不重復的視野，共記錄1 000個細胞，綜合染色強度和陽性細胞數量進行判定。①按切片中細胞著色深淺評分：0分為細胞無顯色；1分為黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色。②按陽性細胞數占同類細胞數的百分比評分：1分為＜25%；2分為≥25%且≤50%；3分為＞50%且≤75%；4分為＞75%。取 ①、②兩項評分的乘積作為總積分：0～3分為（－）；＞3分且≤6分為（＋）；＞6分且≤9分為（＋＋）；＞9分（＋＋＋）。（－／＋）為低表達，（＋＋／＋＋＋）為高表達。

1.7 ES蛋白的表達 每張切片高倍鏡下隨機選取10個不重復的視野，共記錄1 000個細胞。其結果判定同CD34。

1.8 統計學處理 計量資料數據以均數±標準差（x±s）表示，采用SPSS17.0處理。

2 結 果

2.1 CD34表達 實驗前與正常對照組 CD34（9.50±0.68）分Waster大鼠相比，空白對照組心肌CD34（7.28±0.47）分表達明顯減少（P＜0.05）。實驗4周，與空白對照組比較，試驗組與西藥對照組CD34表達均有增多趨勢（P＞0.05）；實驗8周，與空白對照組比較，試驗組與西藥對照組CD34表達均明顯增多（P＜0.05），試驗組與西藥組相比無統計學意義（P＞0.05）。詳見表1。

表1 實驗4周、8周各組大鼠CD34表達積分（x±s）分

2.2 ES蛋白的表達 實驗前，空白對照組ES蛋白光密度值為（4.93±1.21）分，與正常對照組（3.51±0.77）分相比有統計學意義（P＜0.05）。實驗4周，空白對照組ES蛋白光密度值升高（P＜0.05）。與空白對照組比較，試驗組與西藥對照組ES蛋白光密度值均有降低（P＜0.05）。實驗8周，空白對照組ES蛋白光密度值明顯升高，與正常對照組相比存在有統計學意義（P＜0.05）。與空白對照組比較，試驗組與西藥對照組ES蛋白光密度值均明顯降低（P＜0.01）。試驗組與西藥對照組相比無統計學意義（P＜0.05）。詳見表2。

表2 實驗4周、8周各組大鼠ES蛋白密度值表達積分（x±s） 分

3 討 論

高血壓病是以體循環動脈壓增高為主要表現的臨床綜合征，長期還可成為多種心血管疾病的重要危險因素，并影響重要臟器如心、腦、腎的功能，常造成多系統、多臟器的損害［2］。然微血管擔負組織器官的物質轉運功能［3］，且微血管的改變普遍存在于各期EH。因此，改善微血管稀少應成為降壓治療的有效措施。據研究發現微血管稀少與某些微血管抑制因子有關，而在抑制微血管增殖的因子中，內皮抑素（ES）是高效、特異的血管抑制因子，在微血管密度改變、內皮細胞表達抑制中起著重要作用［4］。

據報道ES是1997年O’Reilly等［5］從培養的小鼠內皮細胞瘤（EOMA）上清中分離純化的一種內源性血管生成抑制劑，為20kd分子量蛋白質。Endostin能夠調節內皮細胞中12%的人類基因組表達，能下調促血管形成基因（BFGF－A、bFGF、EGFR、Bc1－2等）的表達，上調抗血管形成基因（ThrombosPondin－1、HIF－1AN、EPhrinB3等）的表達，雙向調節病理性血管發生；下調8個促血管形成信號傳遞途徑：I d和AP－1信號途徑（控制細胞增殖）、HIF 1信號途徑（降低氧消耗 ）、ePhfin和TNF信號途徑（控制細胞遷徙）、NF－κB信號途徑（控制細胞增殖和抗凋亡）、STAT信號途徑（控制細胞增殖和遷徙）、Ets信號途徑（控制細胞遷徙和抗凋亡）以及凝血級聯和黏附分子途徑［6］。Endostatin觸發的是信號調節網絡，具有廣泛的抗血管形成活性引［7］。另外，Endostatin通過與核仁素受體結合，抑制核仁素的磷酸化而發揮抑制內皮細胞增殖的作用；抑制某些腫瘤相關基質金屬蛋白酶原的激活，并與MMP－2的活性部位結合，從而抑制血管內皮細胞遷徙［8］。

因此本研究從標識MVD的CD34表達及ES密度值兩個方面出發，觀測到4周齡SHR已出現CD34表達減少，并隨增齡而加重，同時還觀察到SHR心肌ES蛋白光密度值升高，并隨周齡增加而顯著升高，桑仙降壓顆粒、吲噠帕胺用藥4周后，均可增加CD34表達、降低ES蛋白密度值，實驗8周后，兩藥仍具顯著作用。其機制可能與其降低ES表達密切有關，是否還與其他微血管抑制因子變化有關尚待進一步研究。

［1］ Abraham JA，Mergia A，Whang L，etal.Nucleotide sequence of a bovineclone encoding the angiogenic protein，baesic fibroblast growth factor［J］.Science，1986，233：545.

［2］ 張蘊慧.復方桑仙顆粒治療中老年高血壓病的臨床和實驗研究［D］.濟南：山東中醫藥大學博士學位論文，2001.

［3］ 駱秉銓，韓冰，林榮，等.高血壓病人阻力動脈重構和微血管功能障礙［J］.中國微循環，2005，9（6）：414－416.

［4］ 吳平生，米倉秀人，山本博.血管新生抑制基因在微血管內皮細胞及周皮細胞中的表達及其低氧的影響和機制［J］.嶺南心血管病雜志，2000，6（4）：274.

［5］ 劉承基.腦血管外科學［M］.第2版.南京：江蘇科學技術出版社，2000：1－5.

［6］ 李剛，柴琳.內皮抑素（Endostatin）研究進展［J］.皖南醫學院學報，2010，29（2）：156－158.

［7］ Abdollah IA，Hahnfeld TP，Maercke RC，etal.Endostatins antiangiogenic signaling network［J］.Mol Cell，2004，13（5）：649－663.

［8］ Nybergp，Heikkila P，Sorsat，etal.Endostatininhibits human tongue carcinoma cell invasion and intravasation and blocksthe activation of matrix metalloprotease－2，－9，and－13［J］.J Biol Chem，2003，278（25）：22404－22411.