促紅細胞生成素對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷時腦組織HIF－1α及存活素表達的影響1）

杜 洪，陰懷清，閆煥利，范澤衛(wèi)，郭晉偉

缺氧缺血性腦病（HIE）是引起新生兒急性死亡和慢性神經系統(tǒng)損傷的主要原因之一［1］。促紅細胞生成素（EPO）對缺氧缺血的腦組織有保護作用［2］，但其作用機制尚未完全清楚。本實驗通過建立新生大鼠缺氧缺血性腦損傷（HIBD）模型，觀察EPO對新生大鼠HIBD后腦組織HIF－1α及凋亡相關蛋白存活素（Survivin）表達的影響，探討其發(fā)揮神經保護的可能機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品 一抗：兔抗鼠HIF－1α和Survivin，二抗：即用型SABC試劑盒，細胞凋亡檢測試劑盒（POD），均購自武漢博士德公司。DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。人重組促紅細胞生成素（rhEPO）系成都地奧九泓制藥廠生產。

1.2 動物分組及模型制備 清潔級，封閉群，新生7dWistar大鼠120只，體重12g～16g，雌雄不限，購自山西醫(yī)科大學實驗動物中心。隨機分為假手術組、HIBD組、rhEPO治療組，后兩者根據處死時間亞組：3h組、6h組、12h組、24h組、48h組、3d組、7d組，每組8只。假手術組給予麻醉后切開頸部皮膚，不結扎頸總動脈，不進行缺氧處理。采用經典Rice法［3］制成HIBD動物模型。rhEPO治療組給予麻醉后切開頸部皮膚，結扎左側頸總動脈并置于缺氧倉中（含8%氧氣）2h，模型建立后，分別于缺氧缺血后即刻、24h、48h各時間點連續(xù)腹腔注射rhEPO（5 000IU／kg）。

1.3 標本制備 分別在3h、6h、12h、24h、48h、3d、7d處死各組動物，斷頭取左側腦組織，10%多聚甲醛室溫固定24h，切塊，石蠟包埋后，連續(xù)做冠狀切片。

1.4 免疫組化

1.4.1 HIF－1α的檢測 切片經常規(guī)脫蠟后放置至蒸餾水中，3%H2O2室溫孵育15min，枸櫞酸緩沖液高壓熱修復2.5min，降 溫至室溫，PBS液洗2min×3次，滴加HIF－1α的一抗（1∶200），濕盒置于4℃冰箱中過夜，復溫至室溫，PBS液洗2 min×3次，滴加二抗：抗兔IgG抗體。用DAB顯色劑顯色，蘇木素復染。脫水，透明，中性樹膠封片。陰性對照切片用PBS液代替一抗，余步驟相同。

1.4.2 Survivin的檢測 用Survivin的一抗代替 HIF－1α的一抗，稀釋至濃度1∶100，余步驟與HIF－1α的檢測相同。陰性對照切片也用PBS液代替一抗，余步驟相同。

1.5 圖像分析 采用BI－2000醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司），免疫反應產物用陽性細胞平均灰度值表示。

1.6 TUNEL法檢測神經細胞凋亡 采用TUNEL法定量觀察凋亡細胞。光鏡下觀察，胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞，即凋亡細胞。高倍鏡下（×400）在缺血側皮質區(qū)隨機選取10個非重疊視野，計數500個細胞，計算陽性率即凋亡指數。

1.7 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，數據以均數±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK－q檢驗。

2 結 果

2.1 HIF－1α和Survivin的免疫組化染色 光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，HIF－1α和Survivin陽性染色均呈棕黃色的細顆粒沉積，陽性細胞主要表達于大腦皮層和海馬，陽性著色位于胞質和（或）胞核。陰性對照片中未見該免疫反應產物。

2.1.1 HIF－1α的表達在假手術組中弱或無表達，在缺氧缺血后3h即增強，12h達高峰，后逐漸降低（P＜0.01）；rhEPO治療組12h、24h、48h、3d的HIF－1α蛋白表達水平較 HIBD組均明顯減少（P＜0.05）。詳見表1。

表1 HIF－1α在新生大鼠腦組織中表達（x±s） 平均灰度值

2.1.2 Survivin的表達 Survivin的表達在假手術組中弱或無表達，在缺氧缺血后12h開始增高，7d明顯增高，與假手術組相比，除3h、6h組，其余均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；rhEPO治療組12h、24h、48h、3d的Survivin表達水平較 HIBD組均明顯增高（P＜0.05）。詳見表2。

表2 Survivin在新生大鼠腦組織中的表達（x±s） 平均灰度值

2.2 神經細胞凋亡的變化 細胞AI值在假手術組中較低，在缺氧缺血后6h增加，7d明顯增高，與假手術組相比，除3h組，其余差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；rhEPO治療組24h、48h、3 d、7d細胞AI較HIBD組明顯降低（P＜0.05）。詳見表3。

表3 細胞AI在新生大鼠缺血側腦皮質中的變化（x±s） %

3 討 論

EPO是一種糖蛋白激素，最初發(fā)現(xiàn)由腎和胎肝產生，通過其受體EPOR發(fā)揮作用［4］。EPOR在多種細胞與組織上都有表達，包括神經元、膠質細胞。EPO不僅是一種造血生長因子，而且具有神經營養(yǎng)活性［5］，正常腦組織EPO和EPOR均呈低水平表達，在缺氧缺血時表達均上調，提示有神經保護作用。而外源性EPO生物活性與天然分離的EPO完全相同，并已被證明可通過血腦屏障來彌補內源性EPO的不足以發(fā)揮神經保護作用［6］。其保護作用機制可能包括抗神經元凋亡、抗谷氨酸興奮毒性、抗氧化作用、抗炎作用、減少NO的過度生成、促進血管生成、促進神經元再生和神經營養(yǎng)作用等。但EPO是否可以通過減少HIF－1α的過度表達，及上調Survivin表達而發(fā)揮神經保護作用，國內外報道較少。本實驗觀察EPO對新生大鼠HIBD時腦組織HIF－1α、Survivin表達的影響，探討其作用機制，為EPO的臨床應用提供依據。

HIF－1是近年來在哺乳動物細胞低氧反應中發(fā)現(xiàn)的一種核轉錄調節(jié)因子，其生物活性由α亞基決定，HIF－1α表達嚴格受細胞氧濃度的調節(jié)［7］。HIF－1的下游靶基因有100多個，涉及多種功能［8］。研究發(fā)現(xiàn)，HIF－1α具有雙重作用，對細胞發(fā)揮著凋亡和促凋亡的作用。而Survivin是凋亡抑制蛋白家族的成員。是至今發(fā)現(xiàn)作用最強的凋亡抑制蛋白之一，Survivin既能抑制細胞凋亡，又能誘導調控神經細胞的有絲分裂及生長周期時相，促進神經細胞增殖和血管生成等［9］。

本研究結果表明，HIF－1α于HIBD后3h開始增高，12h達高峰，后降低，因此推測，缺氧狀態(tài)下HIF－1α穩(wěn)定表達，隨著大鼠恢復氧供，HIF－1α即通過泛素蛋白酶體迅速降解，因而表現(xiàn)為先升后降的趨勢，證實缺氧并非是誘導HIF－1α表達增加的唯一機制，可能還與缺氧缺血時間及嚴重程度有關。這與李麗華等［10］觀察趨勢基本一致。近年對Survivin的研究主要集中在腫瘤方面［11，12］，Survivin在正常成人組織中不表達，而在顱腦損傷后高表達［13］。

本研究結果顯示，新生鼠HIBD后腦細胞開始凋亡，Survivin早期升高不明顯，HIF－1α表達明顯升高，提示HIF－1α的表達與細胞凋亡同步，參與了缺氧缺血后腦損傷過程。其可能機制為：HIBD后HIF－1α過度表達時，介導一系列基因轉錄、激活，導致神經毒性，促進神經細胞。HIF－1α在缺氧誘導的細胞凋亡中起關鍵作用［14］。鄭湘榕等［15］研究表明新生鼠腦缺氧缺血可誘導HIF－1α基因的表達，可能促進細胞凋亡的發(fā)生。Survivin的表達抑制了HIBD后腦組織細胞凋亡，可能機制是通過直接或間接作用于天冬氨酶特異性的半胱氨酸酶實現(xiàn)對細胞凋亡的抑制，發(fā)揮腦保護作用；同時促進神經細胞增殖和血管生成參與了損傷后的修復。本實驗證實新生鼠腦缺氧缺血可誘導HIF－1α及Survivin蛋白的表達，二者共同參與了HIBD過程。

本實驗結果顯示，rhEPO治療組HIF－1α的表達降低，而Survivin的表達在HIBD后升高，且細胞凋亡明顯減少，表明外源性EPO在早期可通過減少HIF－1α的表達，提高Survivin表達上調，進而達到抑制缺氧缺血后腦神經元凋亡。從而在新生鼠HIBD時發(fā)揮其腦保護作用，這可能是EPO腦保護作用機制之一，同時發(fā)現(xiàn)，rhEPO治療組7d時Survivin的表達反而降低，避免了因Survivin的過表達而引起腫瘤細胞的發(fā)生，這可能與機體Survivin自身的調控機制有關。

本研究為EPO用于臨床治療新生兒缺血缺氧性腦病提供了理論依據。但如何應用EPO調節(jié)HIF－1α活性的動態(tài)平衡，使其盡可能發(fā)揮對腦損傷有力的作用，尚有待于進一步研究。

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