PEP－1介導銅鋅超氧化物歧化酶對帕金森病小鼠氧化應激損傷的保護作用

陳 濤 賈 佳 葉 飛 汪 健 王世鳳 周少華

盡管帕金森病（Parkinson’s Disease，PD）的病因尚不完全明確，但自由基的形成和氧化應激在其發病機制中發揮了重要作用這一觀點已經取得了共識［1］。氧自由基（oxygen free radicals，OFR）包括超氧陰離子（.O－2），OH，H2O2，它參與生物分子反應，使不飽和脂肪酸生成脂質過氧化物（LPO），后者對蛋白質和DNA產生氧化損傷，導致細胞變性死亡，而超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是清除細胞內自由基，保護細胞免受氧化應激損傷的關鍵酶之一，但外源性SOD受到了血腦屏障的阻礙而限制了其應用。利用基因工程技術合成的PEP－1－銅、鋅超氧化物歧化酶（PEP－1－Cu，Zn－superoxide dismutase，PEP－1－SOD1）與單純SOD1比較，其穿透生物膜或者血腦屏障的能力得到很大程度的提高［2］，為利用SOD1治療與氧自由基產生過多的疾病提供了新的途徑。目前已有PEP－1－SOD1對腦缺血神經保護的實驗研究，但其對PD模型的影響尚未見報道。本實驗主要觀察PEP－1－SOD1對PD模型小鼠的行為學、紋狀體銅、鋅超氧化物歧化酶（SOD1）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH－Px）及丙二醛（MDA）含量的影響，探討其對PD模型有無神經保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及試劑

36只雄性C57／BL小鼠，10月齡，體重（30±2）g，購于武漢大學醫學院動物中心，并隨機分為正常組、模型組及PEP－1－SOD1組各12只。MPTP購自Sigma公司；SOD1、GSH－Px、MDA 試劑盒購自南京建成生物工程研究所。PEP－1－SOD1蛋白購自湖北醫藥學院附屬人民醫院臨床研究所。

1.2 PD模型制備及給藥

PEP－1－SOD1 組 給 予 500μg／kgPEP－1－SOD1腹腔注射，1次／d，模型組和正常組給予等量生理鹽水腹腔注射，連續3 d。參照文獻［3］，第4天開始PEP－1－SOD1組和模型組小鼠腹腔注射 MPTP（30 mg／kg），連續注射5 d，正常組腹腔注射等量生理鹽水。

1.3 行為學檢測與取材

1.3.1 爬桿實驗（Pole test）參照文獻［3］，將一根直徑10 cm、高50 cm木棍垂直豎立，測試小鼠放置在其頂部，記錄其沿桿爬下過程中所需時間。每只小鼠連續測量3次，取其均數。

1.3.2 行為學測試結束后將小鼠麻醉后脫臼處死，快速取視交叉前部腦組織，分離出左右側紋狀體后立即置于－80冰箱內保存。

1.4 SOD1、GSH－Px活性及 MDA含量檢測

取小鼠紋狀體剪碎制成懸液倒入勻漿管中，并加入冷的0.86%生理鹽水0.3 ml進行充分勻漿。將勻漿液以4 000 r／min離心15 min后取上清液待測。SOD1活性測定：黃嘌呤氧化酶催化黃嘌呤反應產生超氧陰離子，超氧陰離子可將反應體系中的輕胺氧化生成亞硝酸鹽，加入顯色劑之后溶液呈現紫紅色，在550 nm波長條件下測定得到吸光值。但是，當含有SOD1酶的樣品加入反應體系之后反應產生的超氧陰離子被SOD酶清除，從而造成紫紅色的亞硝酸鹽生成量減少，溶液吸光度降低，SOD1酶活力越高，則測定管的吸光值越低，根據測定管及對照管吸光值的變化關系可以計算得到SOD1酶的活力。GSH－Px活性測定：用反映體系中谷胱甘肽（GSH）的減少量反應GSH一Px酶的活力。樣品中的GSH在GSH－Px的催化下與H2O2反應生成氧化型谷胱甘肽（GSSG），通過測定樣品中GSH的消耗量，計算得到GSH－Px酶的活力。MDA含量測定：MDA能夠與硫代巴比妥酸（TBA）發生縮合，生成的產物為紅色，在波長532 nm測定的吸光度值可以反映出樣品中MDA含量的高低。

1.5 統計學處理

應用SPSS 13.0軟件包，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差，以P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 3組小鼠行為學測試

注射MPTP后可以看到模型組大鼠協調能力顯著下降，表現為反應遲鈍、肌肉僵硬、攀爬能力差、出現明顯平衡障礙，模型組所需時間為（15.62±0.93）s，較對照組（4.54±0.54）s明顯延長（t＝22.95，P＜0.01）。與模型組比較，PEP－1－SOD1組小鼠行為異常程度明顯減輕，攀爬能力和運動平衡性較前者好，所需時間（7.86±0.84）s明顯縮短（4.54±0.54）s（t＝13.78，P＜0.01）（圖1）。

圖1 3組小鼠爬桿實驗（±s）

2.2 3組小鼠紋狀體組織SOD1、GSH－Px活性及MDA含量的比較

如圖2所示，模型組紋狀體SOD1活性為（17.52±1.03）U／mg prot，同對照組SOD1活性為（31.84±0.92）U／mg prot比較明顯下降 （t＝26.53，P＜0.01），PEP－1－SOD1組紋狀體SOD1活性為（23.74±1.23）U／mg prot，明顯高于模型組（t＝21.39，P＜0.01）。與對照組（26.48±0.86）U／mg prot比較，模型組GSH－Px活性（18.05±0.62）U／mg prot顯著降低（t＝18.37，P＜0.01），而PEP－1－SOD1組 GSH－Px 活 性 （22.21±0.67）U／mg prot與模型組比較明顯升高（t＝13.19，P＜0.01）。

如圖3所示，對照組 MDA含量為（7.75±0.54）nmol／mg prot，模 型 組 為 （11.62±1.32）nmol／mg prot較對照組明顯升高（t＝9.75，P＜0.01），而PEP－1－SOD1組 MDA含量（8.26±0.59）nmol／mgprot較模型組明顯下降（t＝13.92，P＜0.01）。

圖2 3組小鼠紋狀體SOD1、GSH－Px活性比較（±s）

圖3 3組小鼠紋狀體MDA含量比較（±s）

3 討 論

氧化應激產生大量的氧自由基誘導神經元死亡被認為是導致PD黑質細胞死亡病理機制的重要因素［3］。MPTP穿過血腦屏障后形成 MPP＋，MPP＋可抑制酪氨酸羥化酶的活性而減少多巴胺的合成，還可以抑制活性復合體（NADH脫氫酶），增加自由基的生成及氧化應激，引起多巴胺能神經元的凋亡［4］。Zhang等用 MPTP作用于 Cu，Zn－SOD或者GSH－PX基因敲除的小鼠，發現其黑質多巴胺能神經元缺失明顯高于基因正常小鼠［5］。臨床研究顯示，PD患者黑質中過氧化物比正常人明顯增多，紋狀體中 GSH 水 平、GSH－Px的 活 性 顯 著 降 低［6，7］，而GSH－Px和SOD是體內最主要的自由基清除酶物質。GSH－Px廣泛地存在于機體內，能特異地催化還原型谷胱甘肽（GSH）對過氧化氫的還原反應，可以起到保護細胞膜結構和功能完整的作用［8］。

SOD1是細胞中高水平表達的SOD，是SOD的主要形式，在清除體內氧自由基中發揮著重要作用。但SOD1這種生物大分子在生物體內無特異受體和通道，也不能依靠內吞作用等入胞方式進入細胞內。研究顯示，細胞穿透肽PEP－1可與SOD1進行融合，使得SOD1的細胞轉導能力得到顯著提高［9］。在短暫性前腦缺血和腦梗死動物模型中可以觀察到融合蛋白能穿透血腦屏障，使受損的神經元存活能力顯著增加，發揮了神經保護作用［10，11］。

本實驗結果表明，MPTP腹腔注射后小鼠的行為明顯異常，紋狀體SOD1、GSH－Px活性顯著下降，MDA水平明顯升高，而給予PEP－1－SOD1處理后明顯減輕了帕金森病小鼠行為異常，并且可以使其紋狀體的SOD1和GSH－Px活性明顯升高，MDA含量明顯降低。這表明PEP－1－SOD1自由基清除作用較強，能有效減輕脂質過氧化，降低MDA含量，具有神經保護作用。

綜上所述，本研究觀察到氧化應激在MPTP誘導帕金森病小鼠模型中發揮了重要作用。PEP－1－SOD1可減輕其氧化應激損傷、提高機體抗自由基損傷功能，改善小鼠行為學障礙，表現出了明顯的神經保護作用，但有無其他機制參與仍需大量和深入的研究。

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3 段冷昕，李瑞芳，金 瑾，等.黃連解毒湯對MPTP所致帕金森病小鼠的防治作用.中國老年學雜志，2010，7（30）：2004－2006.

4 Nikolaos P，Ioannis P，George Z，et al.Thiol redox state and oxidative stress in midbrain and striatum of weaver mutant mice，a genetic model of nigrostriatal dopamine deficiency.Neuroscience Letters.2005，376（1）：24－28.

5 Smeyne RJ，Jackson－Lewis V.The MPTP model of Parkinson＇s disease.Mol B rain Res，2005，134（1）：57－66.

6 Zhang J，Graham DG.Montine TJ，et al.Enhanced N－methyl－4－phenyl－1，2，3，6－tetrahydropyridine toxicity in mice deficient in CuZn－superoxide dismutase or glutathione peroxidase.Neuropathol Exp Neurol，2000，59（1）：53－61.

7 Eriksen，JL，Dawson，TM.Dickson DW，et al.Caught in the act：alpha－synuclein is the culprit in Parkinson＇s disease.Neuron，2003，40（3）：453－456.

8 Filipov NM，Norwood AB，Sistrunk SC.Strain－specific sensitivity to MPTP of C57BL／6 and BALB／c mice is age dependent.Neuroreport，2009，20（7）：713，717.

9 袁 紅，梁立武，劉 軍，等.氧化應激與帕金森病多巴胺神經元死亡.武警醫學，2007，18（6）：448－450.

10 Eum WS，Kim DW，Hwang IK，et al.In Vivo Protein Transduction：Biologically Active Intact Pep－1－Superoxide Dismutase Fusion Protein Efficiently Protects Againtst Ischemic Insult.Free Radic.Biol，2004，37（10）：1656－1669.

11 董 敏，席剛明，張正洪.PEP－1－SOD1預處理對腦梗死后小鼠海馬神經元的保護.重慶醫學，2010，39（12）：1487－1488.