平喘寧對哮喘大鼠肺組織cAMP/cGMP及TGF-β1mRNA表達的影響

方向明，袁亞美，王麗娜，胡 謙

（安徽中醫學院，安徽 合肥 230038）

平喘寧為治療臨床寒性哮喘的有效方劑，由射干麻黃湯和三子養親湯化裁而成，功效溫肺化痰、止咳平喘、息風止痙，治療寒哮。第二信使cAMP、cGMP可能是陰陽學說的物質基礎之一，多篇文獻報道cGMP含量升高、cAMP/cGMP比值降低是陽虛證的特征，是判斷肺陽虛模型復制成功的指標。TGF-β是已知最強的致纖維化因子之一［1］，其功能的發揮主要取決于TGF-β1。肺組織中的TGF-β1基因表達強度與膠原的含量成明顯正相關［2］，并作為TGF家族的多效細胞因子，在氣道高反應性（AHR）與氣道急性炎癥反應中發揮抑制性作用。但在氣道受到抗原的反復刺激造成慢性炎癥時，氣道中的TGF-β1持續性增高，進而引起或促進氣道重建和肺組織纖維化［3-4］。該實驗通過平喘寧干預寒性哮喘大鼠模型，采用逆轉錄-聚合酶鏈式反應（RTPCR），檢測哮喘大鼠肺臟的TGF-β1mRNA表達水平，研究該藥治療寒性哮喘的分子生物學效應機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 8月齡健康雄性Wistar大鼠70只，體重200 g～220 g，普通級，安徽醫科大學動物實驗中心，許可證號：SCXK（皖）2011-002。

1.1.2 藥物與試劑 平喘寧方藥組成：麻黃、杏仁、蘇子、半夏等，飲片來源：安徽中醫學院國醫堂制劑中心，分別煎制成3級濃度生藥，濃度分別為4.2 g/mL（大劑量）、2.1 g/mL（中劑量）、1.05 g/mL（小劑量）。地塞米松片：上海信誼藥業有限公司產品（批號：030402）；桂龍咳喘寧：山西桂龍醫藥有限公司（批號：Z20053135）。卵蛋白（OVA）（美國Sigma公司，批號：A8040），3%戊巴比妥鈉（德國Merok公司，批號：20070923），SP免疫組化染色試劑盒（中山生物技術有限公司），DAB顯色劑試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司），Trizol試劑（美國Invitrogen公司），逆轉錄試劑盒（Promega公司），目的基因和GAPDH引物（上海捷瑞生物技術有限公司），DEPC（美國Gibico公司），EB（美國Sigma公司）。

1.1.3 實驗儀器 402AI型魚躍牌超聲霧化器（上海魚躍醫療設備有限公司）；CX21型光學顯微鏡，BX51型熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；DNA擴增儀、DU640紫外分光光度計（美國Backman公司）；Eagle EyeⅡ凝膠成像儀（AGENE公司）；DYYⅢ2型電泳儀（北京六一儀器廠）；玻璃勻漿器（中國科大生物技術有限公司）；Speetra classic酶標分析儀（Austria公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 哮喘模型制備及標本采集 將70只大鼠隨機分成空白對照組、模型組、地塞米松組［0.4 mg/（kg·d）］、桂龍咳喘寧組［10 g/（kg·d）］，平喘寧低劑量組［4.9 g/（kg·d）］、平喘寧中劑量組［9.8 g/（kg·d）］、平喘寧高劑量組［19.6 g/（kg·d）］7組，每組10只。第1天、第8天采用大鼠腹腔注射100 g/L卵蛋白生理鹽水混懸液1 mL致敏。采用10 g/L卵蛋白溶液超聲霧化20 min～30 min，1次/d，連續7 d，致大鼠出現點頭、身顫、節律性收腹樣喘促等現象，提示模型復制成功。第15天給藥與誘喘同時進行，并給予寒冷刺激，連續4 w。給藥采用誘喘前30 min灌胃，空白對照組、模型組每天給予等量蒸餾水灌服。末次激發1 h后，采用腹腔注射水合氯醛0.35 mL/100 g麻醉大鼠，打開胸腔，取右肺和左肺組織放入凍存管中，置-80℃冰箱中保存備用。

1.2.2 cAMP/cGMP檢測 按試劑盒說明書進行，該試劑盒為酶標記免疫吸附測定法（ELISA）。利用抗原能吸附到固相載體表面的特性，使cAMP、cGMP抗體反應在固相載體表面進行，分離cAMP、cGMP抗原抗體結合物，在450 nm波長的條件下用酶標儀獲取吸光度（OD值），并測算cAMP、cGMP 濃度。

1.2.3 TGF-β1mRNA測定 根據cDNA文庫與相關文獻［5］，引物由上海捷瑞生物工程有限公司（ISO9001：2008）設計合成。TGF-β1擴增產物長度：231 bp，Forward primer：5′-TGGTGGACCGCAACAACGCAAT-3′，Reverse primer：5′-TGGGGGTCAGCAGCCGGT TA-3′；GAPDH擴增產物長度：431 bp，Forward primer：5′-GGGGCTCTCTGCTCCTCC CTG-3′，Reverse primer：5′-AGGTGAGCCCCAGCCTTCTCC-3′。取100 mg肺組織放于勻漿管內，冰上操作，加入1 mL Trizol溶液，研磨組織后，倒入1.5 mL EP管中，混勻室溫靜置5 min后，每1 mL Trizol溶液中加0.2 mL氯仿，混勻室溫靜置5 min后，15 000 rmp離心15 min。將上層水相轉入新的1.5 mL EP管中，加入0.5 mL異丙醇，混勻后置于-20℃1 h。然后12 000 rmp離心10 min，留取沉淀，加入1 mL 75%乙醇，振蕩洗滌RNA沉淀1次，后7 500 rmp離心5 min，小心倒掉上清，置于超凈工作臺吹干沉淀，再在管中加入20 μL DEPC水溶解完全，即得大鼠肺組織總RNA。取5 μL總RNA點樣于0.8%瓊脂糖凝膠電泳，Eagle EyeⅡ凝膠成像儀觀察電泳條帶，并用DU640紫外分光光度計測算RNA260nm/280nm比值。逆轉錄（RT）：取2μL總RNA加10mMdNTPMix2μL、Oligo（dT）18primer 1 μL 于 100μL EP 管中，再加 Water，nuclease-free 9 μL，5×Reaction buffer 4 μL、Revert AidTMMMulvReverseTranscriptase1 μL，RiboLockTMRNase Inhibitor 1 μL于反應管中，42℃水浴60 min，70℃水浴5 min以失活逆轉錄酶終止逆轉錄反應，冰浴冷卻，即得cDNA。聚合酶鏈式反應（RT-PCR）：先將 TGF-β1、GAPDH 兩對引物稀釋至濃度為10 pmol。加樣依照如下體系進行：cDNA 2 μL，10 pmol Forward primer 1 μL，10 pmol Reverse primer 1 μL，nuclease free water 8.5 μL，PCR Master Mix（2×）12.5 μL，低速離心混勻。反應條件：TGF-beta1：變性 40 s，95℃；退火60℃，40 s；72℃延伸，40 s；共進行 34個循環，最后 72℃延伸7 min，擴增長度片段231 bp。GAPDH：變性 40 s，95℃；退火 60 ℃，40 s；72 ℃延伸，40 s；共進行 34個循環，最后 72℃延伸7 min，擴增長度片段431 bp。PCR產物電泳分析：分別取5 μL PCR產物與1 μL DNA加樣緩沖液混勻，以1%瓊脂糖凝膠電泳，同時加100 bp Marker，其結果用Eagle EyeⅡ凝膠成像儀分析：①確定產物位置；②光密度值掃描（密度代表基因表達豐度）；③半定量計算：TGF-β1mRNA表達豐度/GAPDH表達豐度。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 cAMP/cGMP檢測結果

各組大鼠肺組織cAMP、cGMP含量及cAMP/cGMP比值測算如下，結果見表1。

表1 大鼠肺組織cAMP、cGMP含量參數比較 （nmol/L，）

表1 大鼠肺組織cAMP、cGMP含量參數比較 （nmol/L，）

注：與模型組比較，1）P<0.05，2）P<0.01

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由表1可知，與模型組比較，平喘寧各劑量組肺組cGMP含量降低，cAMP/cGMP升高，差異均有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。

2.2 總RNA純度測定

各組總 RNA 260 nm/280 nm 平均比值為 1.8～2.0［6］，表明總RNA基本無蛋白質污染與降解，RNA純度較好。結果見表2。

表2 各組大鼠肺組織總RNA純度比較

2.3 TGF-β1-mRNA表達豐度半定量

TGF-β1-mRNA表達豐度半定量，以GAPDH為內參，各組PCR產物采用1%瓊脂糖凝膠電泳，用Eagle EyeⅡ凝膠成像儀分析。與模型組比較，平喘寧各劑量組PGF-β1-mRNA 表達率度降低，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。結果見表3，圖1。

表3 各組TGF-β1-mRNA表達豐度半定量比較 （）

表3 各組TGF-β1-mRNA表達豐度半定量比較 （）

注：與空白對照組比較，1）P<0.05，2）P<0.01；與模型組比較，3）P<0.05，4）P<0.01

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3 討論

第二信使cAMP、cGMP可能是陰陽學說的物質基礎之一，具有相互拮抗制約的生物學效應。多家文獻報道cGMP含量升高、cAMP/cGMP比值下降是陽虛證的表現。在肺組織中，cAMP含量上升則舒張支氣管平滑肌，支氣管得以擴張；與之相反，cGMP含量上升則收縮支氣管平滑肌，誘發哮喘［5-7］。該實驗顯示模型組較空白對照組cGMP含量升高、cAMP/cGMP比值下降（P<0.01）；治療組較模型組cGMP含量降低、cAMP/cGMP比值上升（P<0.01，P<0.05）。證明肺陽虛大鼠模型復制成功，并為平喘寧治療寒性哮喘提供了合理性依據。

支氣管哮喘是由多種炎癥細胞浸潤及其分泌的炎性介質與細胞因子共同參與的氣道慢性炎癥，支氣管上皮細胞與氣道平滑肌細胞（ASMC）也參與了這個炎癥過程，而氣道重構則是慢性哮喘反復發作的病理學基礎，是氣流受限甚至不可逆的主要原因，可加重氣道高反應性。氣道上皮下纖維化、ASMC增生與肥大是氣道收縮與重構的主要病理基礎。TGF-β1參與激活ERK通路，嗜酸性粒細胞、上皮細胞和巨噬細胞等細胞都可以分泌 TGF-β1［8-9］。TGF-β1結合胞膜表面受體，激活Ras-Raf-MEK-ERK通路，ERK磷酸化后轉移至細胞核，與轉錄因子相互作用，進而影響相應基因轉錄，導致細胞的特異性表達。TGF-β1在促進膠原蛋白等細胞外基質在肺間質和肺泡間沉積與纖維細胞增殖中起關鍵作用，因此TGF-β1在哮喘發病中起重要作用。平喘寧由射干麻黃湯與三子養親湯化裁而成，功效溫肺化痰、止咳平喘、祛風解痙，主治寒性哮喘。在實驗過程中，模型組、地塞米松組、平喘寧高、中劑量組各死亡1只大鼠，桂龍咳喘寧組、低劑量組死亡2只大鼠，主要在造模、灌胃給藥過程中，原因可能與大鼠過敏有關。

該研究顯示平喘寧能夠顯著降低寒性哮喘大鼠肺組織中TGF-β1RNA的表達水平，從而減輕或逆轉氣道重構，降低氣流受限程度，這可能即是平喘寧有效治療寒性哮喘的分子機制之一。

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