傅氏生化湯提取劑對后肢缺血模型鼠CD34蛋白表達的影響

張均克

（江漢大學醫學院，湖北 武漢 430056）

傅氏生化湯的祛瘀生新功用已被臨床醫生習用，我們將該方作為一種血管新生誘導劑，在大鼠缺血后肢模型中觀察到其促血管新生效應［1］。血管新生是從內皮細胞（endothelial cell，EC）受到刺激而增殖游走開始的，其EC來源于既存的微血管內皮細胞［2］。在正常成人，EC和血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）不進行有絲分裂，但在生長發育、缺血缺氧、炎癥及其他應激情況下，可以發生游走和分裂，從而啟動血管新生的一系列過程［3］。而在血管內皮細胞的標志中，CD34的特異性最高，優于內皮細胞的其他標記物［4］。因此本研究采用免疫組化SABC法檢測大鼠骨骼肌組織中血管內皮細胞CD34的表達水平，用以顯示和計數微血管密度，更好地觀察評價傅氏生化湯促血管新生效應。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 Ⅰ級雄性Wistar大鼠50只，體重約200 g～250 g，購自華中科技大學同濟醫學院實驗動物學部。

1.1.2 試劑與儀器 羊抗兔SABC試劑盒（即用型）、DAB顯色試劑盒、兔抗大鼠CD34單克隆抗體均購自武漢博士德生物工程有限公司。主要實驗儀器有恒冷箱切片機（LEICA CM1900-Cryostat），CS101-2AB電熱干燥箱，隔水式電熱恒溫培養箱及冰箱等。

1.1.3 實驗藥物 實驗用中藥材全部購自武漢市藥材公司，經專業人員鑒定。為使該方的研究結果更能切合于現代臨床，故將當歸、川芎、桃仁、黑姜、炙甘草，按 6∶2∶1.5∶0.5∶0.5的比例，加水浸泡，按常規煎煮2次，每次1 h，合并濾液濃縮至適量，加95%酒精，使含醇量達65%，靜置24 h后，過濾，濾液回收乙醇至盡。加蒸餾水定容使成100%濃度，濾過，灌裝，壓蓋，滅菌備用，此即生化湯口服液（以下簡稱SHT）。依60 kg成人每日1劑原方原量換算出大鼠1 d用量，以此作為中劑量，倍之為大劑量，半之為小劑量。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型復制與分組給藥 大鼠經適應性喂養2 w后開始實驗。動物模型制作按照文獻［3-5］方法進行。將大鼠經戊巴比妥鈉腹腔（50 mg/kg）麻醉后，仰臥位固定，脫毛，消毒，于右腹股溝行縱行切口，暴露和分離股動脈，分別結扎股動脈起止端及其分支，切除股動脈。將大鼠隨機分成空白對照組、模型組、生化湯小劑量組（SHTS）、生化湯中劑量組（SHTM）、生化湯大劑量（SHTL）組 5組，每組 10只大鼠。各治療組術后即開始用生化湯每日定時灌胃，共灌胃用藥30 d。

1.2.2 標本取材及組織切片 實驗第31天取材，將大鼠用7%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.3 mL/體重100 g），剪開胸腔暴露心臟，用灌注針頭刺入大鼠心臟左心室，通過心臟灌注0.85%NaCl溶液150 mL，然后以4%多聚甲醛磷酸緩沖液（PB pH 7.3）300 mL灌注固定。然后取手術后肢的內收肌組織一小塊，置上述固定4 h（4℃）后轉入25% 蔗糖PB液（4℃）24 h。然后恒冷箱切片：-18℃ 20 μm厚，每隔5片取1張，黏至涂有多聚賴氨酸玻片上，置37℃溫箱烤1 h（防脫片）后置室溫保存。

1.2.3 免疫組織化學檢測方法 采用抗生物素-生物素-過氧化酶復合物技術（avidin biotin peroxidase complex technique，ABC法）。按ABC法常規步驟操作。在作特異性顯色的同時，設陰性替代片和空白對照顯色。結果判定依據CD34陽性表達為棕黃色。具體步驟如下：①純甲醇新鮮配制0.5%H2O2，滴加3%H2O2，室溫浸泡30 min，以滅活內源性過氧化物酶。蒸餾水洗3次。②滴加復合消化液，室溫，30 s～60 s。蒸餾水洗，2 min×3次。③滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min。甩去多余液體，不洗。④滴加一抗（兔抗大鼠CD34抗體和Actin抗體，工作濃度均為1∶200；抗體均為即用型）置20℃，2 h。0.02 M PBS洗2 min×3次。⑤滴加生物素化山羊抗兔IgG，置20℃～37℃，20 min。0.02 M PBS洗3 min×3次。⑥滴加SABC，置20℃～37℃，20 min。0.02 M PBS洗2 min×4次。⑦DAB顯色，使用DAB顯色試劑盒。⑧蘇木素輕度復染，脫水，透明，封片。⑨觀察，照相。以正常一抗動物血清和緩沖液代替一抗作陰性對照。

1.2.4 MVD計數 微血管密度（microvasscular density，MVD）計數參照 Weidner N［6］和孫惠川等［7］方法進行。即先用 40倍光鏡掃視整個切片，尋找高血管密度區，作為熱點。再在200倍光鏡視野下計數熱點區被抗CD34抗體染成棕黃色的血管數目。任何染成棕黃染的細胞或細胞簇，即使未顯示管狀結構，只要它們和鄰近的微血管、細胞或其他結締組織分開，就把它們作為一個微血管。計數3個200倍視野下的血管數目，由兩位不知臨床資料的高年病理醫師采用背對背法分別進行，取兩者計數的平均值。

1.2.5 圖像分析 對未復染片采用HPIAS-1000彩色圖象分析系統進行計算機圖像分析。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠骨骼肌組織CD34免疫組化染色計算機圖像分析 結果見表1。

表1 各組大鼠骨骼肌組織CD34免疫組化染色光度比較 （）

表1 各組大鼠骨骼肌組織CD34免疫組化染色光度比較 （）

注：與模型組比較，1）P<0.01；與空白對照組比較，2）P<0.01

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由表1可見，各組的平均光度和積分光度都較空白對照組有所增加，特別是SHT大劑量組明顯增強。表明大鼠在造模以后CD34抗原的表達增強。

2.2 各組大鼠骨骼肌組織MVD計數比較 結果見表2。

表2 各組大鼠骨骼肌組織MVD計數比較 （）

表2 各組大鼠骨骼肌組織MVD計數比較 （）

注：與模型組比較，1）P＜0.05；與空白對照組比較，2）P＜0.05

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由表2可見，與模型組比較，SHTM組和SHTL組大鼠骨骼肌組織MVD計數升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 SHTL組大鼠骨骼肌組織免疫組化染色CD34抗原表達情況

結果見圖1。由圖1可見，CD34陽性表達主要定位于毛細血管壁、肌膜和肌纖維間質。

圖1 SHTL組大鼠骨骼肌組織免疫組化染色CD34抗原表達情況

3 討論

采用免疫組化方法標記微血管來反映血管新生并提供有價值的信息已被大多數學者所認可。血管新生的免疫組化研究是用針對血管內皮細胞（EC）標志物的抗體（抗FⅧ-RA、CD31、CD34等）完成的。1991年，Weidner N 進行一項探索性研究，用免疫組化法抗Ⅷ因子相關抗原（抗FVⅢ-RA）單克隆抗體染色血管內皮細胞膜進行標記血管記數。Horak E R［8］等用另一種血管細胞標記物CD31，并與FⅧ-RA比較，認為抗 CD31比抗 FVⅢ-RA 敏感。Toi M 等［9］也發現 CD31能染色更多的血管。后來認為CD34是較特異和敏感的生長中的血管內皮細胞表面標志，并且有較強的可重復性［10-11］，故本研究采用抗CD34單抗來檢測大鼠骨骼肌組織切片中血管內皮細胞CD34表達狀況，用以反映血管新生狀況。

CD（cluster of differentiation，CD）是位于細胞膜上一類分化抗原的總稱，又稱為白細胞分化抗原，它們是不同譜系（lineage）白細胞（還包括血小板，血管內皮細胞等）在正常分化成熟的不同階段及活化的過程中出現或消失的細胞表面標記。其化學本質是細胞膜上的一類蛋白質或糖蛋白。CD具有重要的生物學意義，不僅可作為表面標志用于細胞的鑒定和分離，還廣泛參與細胞的生長、成熟、分化、發育、遷移、激活。CD34是一種分子量為105 Kda～120 Kda的糖基化跨膜糖蛋白，表達于骨髓細胞和內皮細胞，目前無論是基礎研究還是實際應用中都把CD34作為干細胞的識別標記。此外，CD34還是黏附分子（adhesion molecule）中白細胞選擇素的配體，調控早期造血；又是外周淋巴結地址素（peripheral node addression，PNAd），介導淋巴細胞歸巢（homing）［12］。

CD34在毛細血管及小血管內皮細胞中陽性表達很穩定，被認為是目前血管內皮細胞的最可靠標記［13］，其突出優點是不需向血管內灌注填充劑、示蹤劑等物；不受灌注充盈的影響，對毛細血管無刺激作用；保持了微血管的自然狀態和管徑大小；微血管顯影效果良好，背景染色淺，血管與周圍組織對比明顯，這對進行骨骼肌組織微血管的形態計量學研究十分重要。冰凍切片操作簡便，屬常規方法，可長期保存；血管不易褪色，便于回顧性研究；方法適用范圍廣，人和動物組織均適用，可進行連續切片。本研究采用上述方法，實驗結果顯示，大鼠后肢缺血模型建立以后，CD34表達均有所增強，其微血管密度亦顯著增加，表明后肢缺血以后，啟動了血管新生的生理過程，EC的增生加速，作為血管內皮細胞特異性標記的CD34抗原的表達亦相應增強。因此模型組及SHT各組均比空白對照組顯著增強，MVD增加。但SHT中劑量和大劑量組更為顯著，顯示出一定量效關系，表明傅氏生化湯有促血管新生的作用，初步顯示出該方作為一種血管新生誘導劑的潛在意義。

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