利拉魯肽對糖尿病前期大鼠胰島海馬膽堿能神經刺激肽前體蛋白的影響＊

高 飛，陳 宏，張 樺，郭南京，徐艷花，蔡德鴻

糖尿病前期是介于正常血糖和糖尿病之間的糖代謝紊亂狀態，發病機制與胰島β細胞受損[1]及胰島素抵抗有關[2]。多項研究證實[3－4]，糖尿病前期發生糖尿病、心血管疾病及卒中的風險較高，總死亡率也明顯增加，因此對糖尿病前期的干預至關重要。促絲裂原活化蛋白激酶(mitogen－activated protein kinase，MAPK)信號轉導途徑和膽堿能神經受體系統，分別在胰島β細胞增殖與胰島素分泌中起重要作用。作為MAPK信號轉導途徑的特異性抑制劑，海馬膽堿能神經刺激肽前體蛋白(HCNP－pp)可抑制MAPK信號轉導途徑，減少細胞增殖;HCNP－pp氨基末端經類糜蛋白酶裂解為含11個氨基酸殘基的多肽，即海馬膽堿能神經刺激肽(HCNP)，HCNP在中樞神經系統可促進乙酰膽堿合成，影響膽堿能神經受體系統[5]。胰高血糖素樣多肽(glucagon－like peptide－1，GLP－1)為一種腸促胰島激素，不但可結合自身受體，作用于cAMP－PKA途徑引起胰島素分泌，還可與乙酰膽堿協同活化膽堿能神經受體而引起胰島素分泌[6]。此外，細胞培養及動物實驗均已證實，GLP－1可激活MAPK信號轉導途徑，促進胰島β細胞增殖[7]。然而，GLP－1引起的上述作用是否與HCNP－pp和HCNP相關，目前尚無文獻報道。本研究中，對糖尿病前期OLETF大鼠腹腔注射不同劑量的GLP－1類似物利拉魯肽，探究了利拉魯肽影響胰島β細胞增殖和促胰島素釋放的可能機制。

1 材料和方法

1.1 動物分組與處理

OLETF大鼠(日本大冢制藥株式會社德島研究所惠贈)為膽囊收縮素－A受體基因敲除鼠，因進食量大、體重增加迅速、伴有高胰島素血癥及血糖升高等，可自發2型糖尿病。LETO大鼠是OLETF大鼠同品系自然生長鼠，可作為OLETF大鼠陰性對照組(LETO組)。所有雄性4周齡大鼠均在南方醫科大學實驗動物中心清潔級飼養室普通飼料飼養，溫度(21±2)℃，光照14 h，濕度(60±15)%。所有動物飼養8～10周后，禁食15 h，行口服葡萄糖耐量試驗(葡萄糖2 g/kg，胃管灌入)，以葡萄糖氧化酶法(雅培血糖儀，美國)分別檢測30，60，90，120 min時鼠尾靜脈血糖，糖尿病診斷標準按國際大鼠糖尿病標準，符合血糖峰值大于16.8 mmol/L或餐后2 h血糖大于11.1 mmol/L即為糖尿病前期。分別于給藥2，4，6，8，10，12 周末再次行口服葡萄糖耐量試驗，測各組大鼠體重，并應用酶聯免疫吸附試劑盒(武漢中美科技有限公司)檢測空腹血清胰島素。將處于糖尿病前期的OLETF大鼠隨機分為L－100組、L－200組和 PBO組(安慰劑組)，每組 8只。L－100組和L－200組大鼠分別給予100μg/kg和200μg/kg利拉魯肽(丹麥諾和諾德公司，劑型為預填充注射筆，規格為3 mL∶18 mg)及0.9%氯化鈉注射液1.0 mL/kg，每日2次，腹腔內注射。LETO組和PBO組大鼠給予0.9%氯化鈉注射液腹腔內注射。每兩周行口服葡萄糖耐量試驗，12周后以50%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，提取胰腺組織，行免疫組化染色及蛋白印跡、實時定量PCR等試驗。

1.2 方法

免疫組織化學染色:取經10%甲醛固定的標本，24 h內石蠟包埋，酒精梯度脫水后，行胰島素免疫組化染色，光鏡下觀察胰島細胞形態，應用Image J軟件分析胰島素陽性表達細胞密度值(positivecell denisity，PCD)。

胰腺組織相關基因熒光定量分析:應用Trizol液(Invitrogen公司，美國)裂解胰腺組織，按說明書提取總RNA，－80℃保存。將 HCNP －pp、膽堿乙酰轉移酶(Choline acetyltransferase，ChAT)、3型毒蕈堿受體(type 3 muscarinic receptor，M3R)和GLP－1R基因mRNA序列進行分析，設計特異性引物:HCNP－pp上游引物序列為5'－TGGTGTATGAGCAGGAGCAG－3'，下游引物序列為5'－TCCCAGGTGGTA CTTCTTGC－3'，擴增片段長度116 bp;ChAT上游引物序列為5'－TTCCAA GACACCAAT GACCA－3'，下游引物序列為5'－AGT GGCTGT CCA GCA GAGTT－3'，擴增片段長度85 bp;M3R上游引物預序列為5'－CAT CATTGGCAA CAT CCT TG－3'，下游引物序列為5'－AGGCCA GGCTTA AGA GGA AG－3'，擴增片段長度89 bp;GLP－1R上游引物序列為5'－CCT GAG GAA CAGCTCCTG TC－3'，下游引物序列為 5'－CTG GTG CAG TGCAAG TGT CT－3'，擴增片段長度119 bp。引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。應用ABI 7500 Real－time PCR 儀(Applied Biosystems Inc，美國)和 Syber Green RNA擴增試劑盒(Takara生物技術公司，中國)，采用一步法進行RT－PCR反應，反應方案依據試劑盒操作步驟。實時定量PCR體系(20μL):實時熒光定量試劑2×SYBR Premix Ex TaTM 10μL，ROXReference DyeⅡ0.4μL，10μmol/μL 上、下游引物各 0.4μL，cDNA模板 1.0μL，雙蒸水 17.8μL。反應條件:94℃預反應5 min;94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環，于每個循環延伸反應最后時刻收集熒光信號。

胰腺組織HCNP－pp和GLP－1R蛋白表達分析:采用Western印跡方法，以增強化學發光法顯示蛋白條帶，用Universal hoodⅡ凝膠成像系統(捷達科技發展有限公司，中國)成像，ImageJ軟件分析條帶灰度值，β－actin作為內參照。一抗購于美國Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶標記的二抗、增強化學發光試劑盒和硝酸纖維素膜購于美國Amersham公司。

1.3 數據處理及統計分析

數據均采用SPSS13.0軟件進行統計學處理分析，計量資料用X±s表示，對結果進行正態性及方差齊性檢驗，組間比較用單因素方差分析檢驗。P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結果

2.1 大鼠體重、口服葡萄糖耐量試驗及空腹胰島素

經12周藥物處理，PBO組大鼠體重、血糖、空腹血清胰島素均明顯高于L－100組，L－200組及LETO組，差異具有統計學意義。見表1。

2.2 胰島免疫組化形態學分析

光鏡光鏡下觀察，LETO組胰島形態規則、結構完整，胰島內PCD分布均勻;PBO組胰島內PCD明顯減小，分布不均勻;L－100組胰島內PCD較PBO組無明顯改善，L－200組胰島形態明顯改善，胰島內PCD較PBO組明顯增加。見圖1和表1。

圖1 光鏡下胰腺胰島素免疫組化染色(×400)

表1 4組大鼠體重、血糖、胰島素抵抗指數及胰島素陽性細胞密度(X±s)

2.3 大鼠胰腺組織相關基因表達情況

與 PBO組比較，LETO組、L－100組、L－200組 HCNP－pp相對表達水平下降，ChAT，M3R，GLP－1RmRNA相對表達水平均明顯增高，差異具有統計學意義。見圖2和表2。

2.4 大鼠胰腺組織HCNP－pp和GLP－1R蛋白表達情況

與 PBO組比較，L－100組、L－200組、LETO組 CTHCNP－pp和NT－HCNP－pp蛋白相對含量均明顯減低，GLP－1R蛋白相對含量均明顯增高，差異具有統計學意義。見圖3和表3。

圖2 大鼠胰腺 HCNP－pp，ChAT，M3R，GLP－1RmRNA表達

表 2 4組大鼠 HCNP－pp，ChAT，M3R，GLP－1RmRNA相對含量(×105拷貝，X±s)

圖3 大鼠胰腺HCNPpp和GLP－1R蛋白含量表達

表3 4組大鼠HCNP－pp，GLP－1R蛋白水平相對含量(X±s)

3 討論

利拉魯肽作為人GLP－1類似物，因增加了脂肪酸側鏈，可阻止二肽基肽酶Ⅳ(DPP－Ⅳ)的降解，延長對胰島β細胞的作用。利拉魯肽不但顯著提高β細胞功能，還可增加β細胞體積及數量[8－9]。本研究結果顯示，對糖尿病前期OLETF大鼠腹腔注射不同劑量的利拉魯肽，具有改善胰島增殖及分泌功能的作用，從而延緩糖尿病的發生。HCNP－pp可與Raf－1蛋白激酶結合，干擾Raf－1對MAPKK的磷酸化和激活，進一步抑制MAPK途徑，阻止細胞增殖[10]。Zhang等[11]通過熒光雙染、免疫組化染色等技術顯示，HCNP－pp特異存在于胰島細胞，可抑制MAPK信號途徑，抑制胰島β細胞增殖。因HCNP分子量較小，蛋白印跡技術不能表達其含量，故將其增強發光，以硝酸纖維素膜洗脫羧基端HCNP－pp蛋白抗體后，重新加用氨基端HCNP－pp蛋白特異抗體，應用氨基端與羧基端HCNP－pp蛋白相對含量的比值間接表示其含量。

本研究結果顯示，IGT－OLETF大鼠GLP－1R，CT－HCNP－pp，NT－HCNP－pp蛋白表達水平增高、氨基及羧基末端HCNP－pp比值增高，GLP－1R，ChAT，M3R基因表達水平明顯下降，HCNP－pp基因表達水平上升，表明糖尿病前期OLETF大鼠腸促胰島激素作用下降、胰島細胞HCNP－pp增多，出現血糖升高、胰島β細胞增殖能力下降，膽堿能神經受體系統受損，進而導致血糖升高、胰島素抵抗、胰島細胞PCD顯著下降;經過12周利拉魯肽干預，OLETF大鼠不僅進食量、體重、血糖顯著降低，HCNP－pp蛋白、基因表達水平以及NT－HCNP－pp/CT－HCNP－pp比值均相應下降，GLP－1R蛋白表達水平及GLP－1R基因表達水平升高，ChAT和M3R基因表達水平升高。因此推測，利拉魯肽不但可減少HCNP－pp產生、活化MAPK信號轉導途徑、促進β細胞增殖，而且可促進HCNP－pp裂解，使HCNP增多，進一步作用于膽堿能神經系統，促進胰島素釋放。

本研究還顯示，不同劑量利拉魯肽干預的OLETF大鼠在胰島形態學方面有所差異，L－100組大鼠胰島細胞形態及胰島素陽性細胞數同安慰劑組比較均無明顯改善，結合L－100組大鼠M3R基因表達水平無明顯升高，推測利拉魯肽(100μg/kg)對處于糖尿病前期的OLETF大鼠胰島β細胞增殖無改善，可能僅通過對GLP－1受體的作用提高胰島素分泌，改善糖尿病前期狀態。

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