結(jié)核性胸膜炎患者胸液中CD4+CD25+FoxP3+調(diào)節(jié)T細(xì)胞抑制抗結(jié)核免疫

胡良安 王曉虹 劉金華 羅永艾

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院肺科，重慶 400016)

CD4+CD25+FoxP3+調(diào)節(jié)T細(xì)胞，也稱CD4+CD25+調(diào)節(jié)T 細(xì)胞產(chǎn)生于胸腺，它主要作用是抑制逃避了其他耐受機(jī)制的自身反應(yīng)T細(xì)胞的活化及功能〔1〕，這樣使機(jī)體保持自身耐受，防止自身免疫性疾病的產(chǎn)生，但這也削弱了機(jī)體對感染的病原菌的免疫抑制反應(yīng)。決定結(jié)核菌感染呈慢性化的因素和結(jié)核特異免疫反應(yīng)被抑制的原因目前不清楚。然而，在人類包括巨細(xì)胞病毒、HBV、HCV、HIV在內(nèi)的慢性感染中發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+調(diào)節(jié)T細(xì)胞在免疫抑制中起重要作用〔2〕，我們推測這些調(diào)節(jié)細(xì)胞在結(jié)核病的特異免疫中也可能起抑制作用。因?yàn)榻Y(jié)核性胸膜炎的抗結(jié)核免疫反應(yīng)局限在胸膜腔中，所以結(jié)核胸膜炎是研究體內(nèi)病灶局部免疫反應(yīng)的理想模型，因此我們研究結(jié)核胸膜炎患者胸液中是否有CD4+CD25+調(diào)節(jié)T細(xì)胞存在，及其是否有調(diào)節(jié)免疫功能。

1 對象與方法

1.1 研究對象的選擇及實(shí)驗(yàn)樣本的獲取 研究對象符合病理，或臨床、X線及后繼的抗結(jié)核治療有效的結(jié)核性胸膜炎患者15例，年齡21～58歲，平均37.5歲，男6例，女9例，胸膜活檢診斷結(jié)核及抗癆治療有效12例，臨床表現(xiàn)、X線表現(xiàn)及抗癆治療有效3例，PPD陽性14例，PPD陰性1例，BCG接種史15例。排除患乙肝、丙肝、HIV、腫瘤、糖尿病、甲亢、哮喘、自身免疫性疾病的患者，以及使用影響機(jī)體免疫功能藥物者。結(jié)核性胸膜炎患者15例，在治療前獲取研究樣本;選擇年齡、性別與患者無差異的健康人作正常對照者17例，年齡24～46歲，平均32.6歲，男8例，女9例，PPD陽性17例，BCG接觸史17例。研究對象都在醫(yī)院倫理委員會(huì)制定的參與該實(shí)驗(yàn)知情同意書上簽名，同意參加該實(shí)驗(yàn)。從研究對象獲取外周靜脈血25 ml，結(jié)核性胸膜炎患者同時(shí)抽取胸液50～200 ml。

1.2 細(xì)胞分離 用Ficoll-Hypaque密透離心法分離抗凝外周血得外周血單核細(xì)胞(PBMCs);使用胸液液體50～200 ml，離心獲得胸液單核細(xì)胞(PFMCs)。獲得的血漿及胸液離心后的上清液-70℃貯存用于檢測干擾素(INF)-γ。這些單核細(xì)胞用CD4陰性選擇磁珠分離獲得CD4+細(xì)胞，剩余細(xì)胞為CD4-細(xì)胞;再用CD25陽性選擇磁珠分離CD4+細(xì)胞獲得CD4+CD25+細(xì)胞，剩余為CD4+CD25-細(xì)胞。獲得的CD4-和CD4+CD25-作為去除調(diào)節(jié)T細(xì)胞的淋巴細(xì)胞貯存?zhèn)溆?。磁珠分離按試劑盒(德國Miltenyi Biotech公司)說明書操作。

1.3 流式細(xì)胞分析 對上述分離的各種細(xì)胞用流式細(xì)胞分析:FITC-anti-CD4，PE-anti-CD8，CY5-anti-CD3(法國 Immunotech公司)三種熒光抗體染色30 min后(使用FIFC-鼠IgG1，PE-鼠IgG1，CY5-鼠IgG作同型對照)，再用 CY5-antiCD4(法國 Immunotech公司)，F(xiàn)ITC-anti-CD25(美國 Ebioscience產(chǎn)品)，PE-anti-FOXP3(美國Ebioscience產(chǎn)品)染色(操作按說明書進(jìn)行)(用同型相應(yīng)抗體作對照)。1%多聚甲醛固定細(xì)胞后用流式細(xì)胞分析儀檢測標(biāo)本。

通過流式細(xì)胞分析可以檢測經(jīng)細(xì)胞分離所得上述各種細(xì)胞的純度，CD4+CD25+細(xì)胞用于 FOXP3的表達(dá)分析，CD4+CD25+FOXP3+細(xì)胞占CD4+CD25+細(xì)胞或CD4+細(xì)胞或混合淋巴細(xì)胞的百分比在各組中作比較。

1.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 取病人及正常人的2×104新鮮分離的PBMCS或去調(diào)節(jié)T細(xì)胞的PBMCS放于96孔板10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基200μl中，同時(shí)再加入10μg/ml BCG，各一式三份。培養(yǎng)72 h后吸出100μl上清液作IFN-γ檢測。胸液單核細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)方法與上述相同。

1.5 細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn) 取細(xì)胞分離獲得的CD4+CD25-細(xì)胞(2×104/孔)加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中作為效應(yīng)細(xì)胞，在沒有或有不同數(shù)量的CD4+CD25+細(xì)胞條件下，再加入10μg/ml BCG，各一式三份。加入1×105經(jīng)過絲裂霉素(美國Sigma公司)處理的單核細(xì)胞培養(yǎng)5 d，取上清液測INF-γ。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以x±s表示，使用方差分析、t檢驗(yàn)判斷相差的顯著性。

2 結(jié)果

2.1 CD4+CD25+FOXP3+細(xì)胞占CD4+細(xì)胞總數(shù)百分比 結(jié)核胸膜炎患者胸液CD4+CD25+FOXP3+細(xì)胞數(shù)占CD4+細(xì)胞總數(shù)的百分比顯著高于結(jié)核胸膜炎患者自身外周血(P＜0.05)及正常人外周血(P＜0.01)，結(jié)核胸膜炎病人外周血CD4+CD25+FOXP3+細(xì)胞數(shù)占CD4+細(xì)胞總數(shù)的百分比顯著高于正常人(P＜0.01)(如表1);同時(shí)結(jié)核胸膜炎患者胸液CD4+CD25+FOXP3+細(xì)胞數(shù)占淋巴細(xì)胞總數(shù)的百分比顯著高于結(jié)核胸膜炎患者自身外周血(P＜0.01)及正常人外周血(P＜0.01)，結(jié)核胸膜炎病人外周血CD4+CD25+FOXP3+細(xì)胞數(shù)占淋巴細(xì)胞總數(shù)的百分比顯著高于正常人(P＜0.01)。見表1。

表1 結(jié)核胸膜炎患者CD4+CD25+FOXP3+細(xì)胞數(shù)增多(x±s)

2.2 外周血白細(xì)胞對BCG的刺激反應(yīng) 病人胸液(P＜0.05)及外周血白細(xì)胞對BCG抗原刺激后產(chǎn)生IFN-γ的能力比對照人群外周血白細(xì)胞明顯增強(qiáng)〔(1 119±555.3)，(884.5±319.5)vs(500.7±176.3)pg/ml，P ＜0.05〕;且病人胸液比外周血白細(xì)胞對BCG抗原刺激后產(chǎn)生IFN-γ的能力也明顯增強(qiáng)(P＜0.05)。

2.3 除去CD4+CD25+細(xì)胞IFN-γ的水平 在BCG的刺激條件下，除去CD4+CD25+細(xì)胞的結(jié)核性胸膜炎病人(10個(gè)病人)胸液單核細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ顯著增強(qiáng)(P＜0.05)，而不能對正常人(7例)除去CD4+CD25+細(xì)胞后的外周血白細(xì)胞有促進(jìn)作用。見表2。

2.4 抑制實(shí)驗(yàn) 從結(jié)核性胸膜炎病人胸液PFMCs(5個(gè)病人)及外周血PBMCs(8個(gè)病人)中分離CD4+CD25+細(xì)胞和CD4+CD25-細(xì)胞。用5×104數(shù)目的CD4+CD25-細(xì)胞與同一個(gè)體相同樣本(胸液或外周血)分離的CD4+CD25+細(xì)胞以不同比例共同培養(yǎng)時(shí)，用BCG刺激，檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ的濃度。結(jié)果見圖1，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ的濃度隨CD4+CD25+細(xì)胞數(shù)量的減少而增加(P＜0.01);而且胸液CD4+CD25+細(xì)胞比外周血CD4+CD25+細(xì)胞抑制CD4+CD25-細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的 作用更強(qiáng)(P＜0.01)。抑制作用更強(qiáng)(比病人外周血中CD4+CD25+細(xì)胞)。CD4+CD25+細(xì)胞抑制結(jié)核特異細(xì)胞免疫力，在體內(nèi)可能對結(jié)核細(xì)胞免疫也有抑制功能。結(jié)核性胸膜炎病人胸膜腔CD4+CD25+細(xì)胞的增多提示免疫反應(yīng)在炎癥組織中增強(qiáng)了，因此，雖然我們觀察到病灶組織CD4+CD25+細(xì)胞數(shù)量增多，活性增強(qiáng)，但病灶組織中仍然存在炎癥，這說明在結(jié)核胸膜炎中，免疫抑制不能完全阻止胸膜腔的免疫病理反應(yīng)。

表2 除去CD4+CD25+FOXP3+細(xì)胞后，患者單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的能力增強(qiáng)(x±s)

圖1 抑制實(shí)驗(yàn)

3 討論

研究提示結(jié)核病灶局部的調(diào)節(jié)T細(xì)胞增高，然而，因病例數(shù)太少，與正常人比較無顯著差異〔3〕，另有報(bào)道也提示肺結(jié)核病人肺病灶組織中調(diào)節(jié)T細(xì)胞量比外周血中高〔4〕。

我們研究發(fā)現(xiàn):結(jié)核胸膜炎胸液中CD4+CD25+細(xì)胞占總的CD4+細(xì)胞或總的淋巴細(xì)胞的百分比明顯高于結(jié)核患者自身外周血和正常人外周血中CD4+CD25+細(xì)胞，結(jié)核患者外周血中CD4+CD25+細(xì)胞占總的CD4+細(xì)胞或總的淋巴細(xì)胞的百分比也高于正常人外周血中CD4+CD25+細(xì)胞，與以前的研究一致〔5，6〕。這進(jìn)一步堅(jiān)定了CD4+CD25+調(diào)節(jié)細(xì)胞聚積在結(jié)核菌感染病灶的局部，然而不能肯定這些調(diào)節(jié)細(xì)胞是局部增殖或是從血中滲出增加的結(jié)果，但我們推測胸液中CD4+CD25+細(xì)胞的增加可能是由于細(xì)胞募集，因?yàn)橐炎C明人體CD4+CD25+細(xì)胞可移動(dòng)集聚到腹水中，但很少進(jìn)入引流淋巴結(jié)，CCL22起介導(dǎo)作用〔7，8〕。

本研究表明從結(jié)核性胸膜炎病人胸液單核細(xì)胞和病人外周血單核細(xì)胞中除去CD4+CD25+細(xì)胞后，這些剩余單核細(xì)胞對BCG刺激產(chǎn)生IFN-γ的能力明顯增強(qiáng)了，但是來自正常人群的外周血單核細(xì)胞無這些作用，這間接證明了結(jié)核性胸膜炎病人CD4+CD25+細(xì)胞抑制增殖反應(yīng)。胸液中CD4+CD25+細(xì)胞

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