RG－14260與雷帕霉素聯(lián)合給藥對兩株子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的作用

鄧守恒 喻雄杰 曹鳳軍 柯賢柱 陳 萍 石小燕

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院腫瘤中心，湖北 十堰 442000)

子宮內(nèi)膜癌是中老年婦女常見的惡性腫瘤之一，近年來，發(fā)病有年輕化趨勢，但其發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚。已知子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展與一些信號通路的活性改變密切相關(guān)，其中主要包括表皮生長因子受體 (EGFR)和雷帕霉素靶蛋白(mTOR)兩條信號通路。當(dāng)前，抑制相關(guān)信號通路已成為腫瘤靶向治療的熱點，故本研究擬以人10號染色體上缺失的磷酸酶和張力蛋白類似物 (PTEN)表達(dá)不同的兩株子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株 (PTEN缺失的 Ishikawa細(xì)胞和 PTEN表達(dá)完整的HEC－1A細(xì)胞)為研究對象，采用特異性信號通路抑制劑對兩株細(xì)胞中EGFR及mTOR兩條通路進(jìn)行干預(yù)，探討不同PTEN狀態(tài)下兩條信號通路在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中的可能作用，為進(jìn)一步闡明發(fā)病機(jī)制，合理選擇抗腫瘤藥物提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品試劑與儀器 表皮生長因子(EGF)、噻唑喃(MTT)、碘化丙啶(PI)為Sigma產(chǎn)品;EGFR抑制劑RG－14620(RG)、mTOR抑制劑雷帕霉素(RA)購自美國Biomol公司;兔抗人pAKT及β－actin單抗及山羊抗兔的二抗購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;ECL發(fā)光液購于Pierce公司;其他試劑均為進(jìn)口分裝分析純;Mod 550型全自動酶標(biāo)儀(美國Bio－Rad公司);Epics Elite ESP型流式細(xì)胞儀(美國Coulter公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 兩株子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株(Ishikawa和HEC－1A)由本院臨床醫(yī)學(xué)研究所提供，培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，于37℃、飽和濕度，5%CO2條件下培養(yǎng)。兩株細(xì)胞分別經(jīng)EGF預(yù)處理2 h，并分別給予10 μmol/L RG、10 μmol/L RA、10 μmol/L+10 μmol/L RA，另設(shè)空白對照細(xì)胞(未給予任何信號通路抑制劑)。

1.2.2 單獨(dú)及聯(lián)合給藥對細(xì)胞的抑制作用經(jīng)不同抑制劑處理24 h后的各種細(xì)胞以1×104個/ml接種至96孔板，每孔100 μl，每組設(shè)3個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后每孔加入5 mg/ml MTT 10 μl，作用 2 h 后棄去上清液，150 μl二甲基亞砜作用 30 min，上全自動酶標(biāo)液在570 nm波長下讀取各孔吸光度A值，計算細(xì)胞抑制率。細(xì)胞抑制率=(對照組吸光度－藥物組吸光度)/對照組吸光度×100%。

1.2.3 流式法檢測細(xì)胞周期及凋亡 收集消化經(jīng)不同抑制劑處理24 h后的各組細(xì)胞，0.01 mol/L PBS0.5 ml重懸細(xì)胞，加70%乙醇1 ml，－20℃固定24 h，加入 PI(終濃度為50 μl/ml)和RNA酶(終濃度為0.25 mg/ml)，室溫下避光孵育30 min后流式細(xì)胞儀作DNA分析，以ModFit LT軟件分析，擬合計算各時相細(xì)胞的百分比。

1.2.4 Western印跡法檢測pAKT表達(dá)量 收集經(jīng)不同抑制劑處理24 h后的各組細(xì)胞，PBS洗2次，裂解，離心，收集上清，即為細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行蛋白定量，調(diào)節(jié)每份樣品蛋白濃度，加等量蛋白于上樣緩沖液，煮沸，在SDS聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳。電泳后轉(zhuǎn)膜，依次加入pAKT一抗和二抗，加入底物液顯色，拍照。蛋白條帶用Quanti Scan軟件進(jìn)行密度掃描分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 以金氏公式〔1〕q=E(a+b)/〔(Ea+Eb)－Ea×Eb〕評價藥物合用對體外細(xì)胞毒是否有協(xié)同作用:E(a+b)為合用抑制率，Ea和Eb分別為A藥和B藥的抑制率。分子為實測合并效應(yīng)，分母為期望合并效應(yīng)，q=0.85～1.15為單獨(dú)相加(+)，q=1.15～2.0為增強(qiáng)()，q＞2.0為明顯增強(qiáng)()，q＜0.85～0.55為拮抗(－)，q＜0.55為明顯拮抗(－－)。數(shù)據(jù)以±s表示，應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 聯(lián)合給藥對細(xì)胞增殖的抑制作用 10 μmol/L RG和10 μmol/L RA對PTEN表達(dá)陽性的HEC－1A細(xì)胞增殖抑制率分別為29.1%和28.3%，二者合用，則抑制率提高至41.6%，合用產(chǎn)生的抑制率大于兩藥單獨(dú)使用，q值為0.85，表明兩藥合用產(chǎn)生的作用僅勉強(qiáng)達(dá)到兩藥單獨(dú)相加，未產(chǎn)生協(xié)同效果。10 μmol/L RG和10 μmol/L RA對 PTEN表達(dá)陰性的 Ishikawa細(xì)胞增殖抑制率分別為44.5%和40.7%，二者合用，則抑制率提高至77.1%，合用產(chǎn)生抑制率大于兩藥單獨(dú)使用，q值為1.17，表明兩藥合用產(chǎn)生的作用遠(yuǎn)大于兩藥單獨(dú)相加，產(chǎn)生協(xié)同效果。兩種細(xì)胞株比較，Ishikawa細(xì)胞對信號通路抑制劑作用更為敏感(表1)。

2.2 兩株子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布的比較 從表2可見，經(jīng)RG和RA兩種信號通路抑制劑作用后，Ishikawa細(xì)胞凋亡率明顯高于HEC－1A細(xì)胞，尤其以二藥合用后效果更為明顯。經(jīng)抑制劑作用后，Ishikawa細(xì)胞G1期細(xì)胞比例明顯升高，S期細(xì)胞比例明顯降低，尤其以RG和RA合用后效果更為明顯(P＜0.01)，HEC－1A細(xì)胞也有上述變化趨勢，但效果不如Ishikawa細(xì)胞顯著(P＞0.05)。

2.3 Western印跡檢測兩株子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中pAKT蛋白的表達(dá) 從圖1中可見，Ishikawa細(xì)胞中pAKT表達(dá)量較高(灰度值為0.667±0.021)，而經(jīng)RA和RG單獨(dú)或聯(lián)合作用24 h后，pAKT表達(dá)量明顯減少(灰度值分別為 0.421±0.076和0.407±0.059，P＜0.05)，尤其以二藥聯(lián)合作用效果最為明顯(灰度值為0.326±0.046，P ＜0.01)。相比之下，HEC－1A 細(xì)胞中pAKT表達(dá)量則較低，經(jīng)二藥單獨(dú)或聯(lián)合作用后，pAKT表達(dá)量變化則不明顯。

表1 RG與RA單獨(dú)和合用對兩株子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖抑制作用(n=4)

表2 RG與RA單獨(dú)和合用對兩株子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布影響(n=4)

圖1 兩株子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中pAKT蛋白的變化

3 討論

人類腫瘤的發(fā)生是多種基因共同作用的結(jié)果，癌基因的激活和抑癌基因的失活或突變是其發(fā)生、浸潤和轉(zhuǎn)移的主要分子基礎(chǔ)。EGFR是一種跨膜酪氨酸激酶受體，基因擴(kuò)增引起的EGFR過表達(dá)從而激活下游的PI3K/AKT/mTOR或(和)MAPK信號通路是許多人類腫瘤的特征之一〔2，3〕。

將一種抗EGFR抑制劑與其他分子靶向治療相結(jié)合正成為抗腫瘤治療的研究熱點，原因在于，其一，一種腫瘤不太可能只依賴于一種受體或是一條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來維持其自身的生長和生存。其二，在信號網(wǎng)絡(luò)中不同受體之間存在相當(dāng)程度的代償性信號通路。將抗EGFR受體治療與抗Ras療法〔4〕或是針對Ras下游分子如Raf/MEK/MAPK的治療結(jié)合已經(jīng)成為可能。同時，越來越多的證據(jù)也證實了抗EGFR受體治療與阻斷其下游PI3K/Akt/mTOR通路的藥物聯(lián)合應(yīng)用的合理性和可行性〔5，6〕。

筆者將EGFR和mTOR抑制劑單獨(dú)和聯(lián)合作用于兩株不同子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Ishikawa細(xì)胞對抑制劑作用敏感，表現(xiàn)為細(xì)胞抑制率和凋亡率高，S期細(xì)胞數(shù)量明顯減少，兩藥合用效果呈協(xié)同作用。而HEC－1A細(xì)胞則不敏感，這與Steelman等人研究結(jié)果相一致〔7〕，可能是由于兩株細(xì)胞中存在著PTEN基因的不同表達(dá)所致，該基因表達(dá)的PTEN蛋白定位于胞漿，由403個氨基酸組成，可通過雙重磷酸酯酶活性負(fù)性調(diào)控三條途徑:PI3K/AKT/mTOR途徑、FAK途徑、MAPK途徑來調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖、凋亡、細(xì)胞遷移、血管生長等。Ishikawa細(xì)胞中由于缺乏PTEN蛋白，使得下游PI3K/AKT/mTOR呈一種慢性激活狀態(tài)，表達(dá)為pAKT數(shù)量較高，經(jīng)抑制劑作用后，pAKT數(shù)量又很快降低，而HEC－1A細(xì)胞中則看不到這些現(xiàn)象，提示PTEN狀態(tài)還與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞對相關(guān)信號通路抑制劑的敏感性相關(guān)，PTEN基因的表達(dá)水平可成為預(yù)測相關(guān)信號通路抑制劑敏感與否的標(biāo)志物之一，這為合理選擇化療方案提供了一個標(biāo)志。

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7 Steelman LS，Navolanic PM，Sokolosky ML，et al.Suppression of PTEN function increases breast cancer chemotherapeutic drug resistance while conferring sensitivity to mTOR inhibitors〔J〕.Oncogene，2008;27(2):4086－95.