替羅非班早期干預(yù)對(duì)非ST抬高型急性冠脈綜合征患者M(jìn)MP－9與sCD40L 表達(dá)的影響

張利峰，王光輝，張俊芳，王桂東

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是危害人類(lèi)健康的常見(jiàn)心血管疾病，是引起死亡的主要原因之一，目前認(rèn)為AS是一種炎癥性疾病，其發(fā)生、發(fā)展的各個(gè)階段符合慢性炎癥的表現(xiàn)[1]。近年來(lái)CD40和CD40配體（CD40ligand，CD40L）在AS發(fā)生和斑塊穩(wěn)定性中的作用日益引起人們的重視。急性冠脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）有共同的病理生理，即冠狀動(dòng)脈粥樣斑塊破裂，形成血栓，使冠狀動(dòng)脈血管部分或完全閉塞，導(dǎo)致心肌缺血或梗死。而血小板的活化、黏附和聚集是動(dòng)脈血栓形成過(guò)程中的關(guān)鍵步驟。激活的血小板釋放的可溶性CD40配體（sCD40L）對(duì)研究ACS的發(fā)生、發(fā)展具有重要價(jià)值[2]?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一種依賴(lài)Zn2＋和Ca2＋的酶家族，能特異性地與細(xì)胞外基質(zhì)各成分相結(jié)合，并降解胞外基質(zhì)。MMPs的活性與斑塊不穩(wěn)定性密切相關(guān)，其中以基質(zhì)金屬蛋白酶－9（MMP－9）關(guān)系最為密切[3，4]。

本研究選擇非ST抬高型急性冠脈綜合征患者，采用替羅非班干預(yù)，觀(guān)察對(duì)MMP－9、可溶性CD40配體（sCD40L）的影響，進(jìn)一步探討替羅非班對(duì)斑塊穩(wěn)定性和抑制免疫炎癥的可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2011年1月—2011年5月本院心內(nèi)科ACS患者120例，其中男60例，女60例，年齡42歲～75歲。全部病例達(dá)到不穩(wěn)定型心絞痛或非ST段抬高型急性心肌梗死診斷標(biāo)準(zhǔn)，并且TIMI評(píng)分在3分以上為入選標(biāo)準(zhǔn)。排除各種急慢性感染性疾病、糖尿病酮癥、腎臟、肝臟疾患、Graves病、肺間質(zhì)纖維化、結(jié)締組織病及腫瘤、外周血管病和腦血管病。將上述患者隨機(jī)分為常規(guī)治療組與替羅非班組，年齡分別為（55.1±8.9）歲、（52.5±9.8）歲，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 全部病例行常規(guī)治療，包括抗血小板、抗凝、擴(kuò)冠治療；常規(guī)治療未應(yīng)用替羅非班，替羅非班組加用替羅非班（欣維寧，武漢遠(yuǎn)大制藥），用量根據(jù)體重計(jì)算，起始推注劑量為10μg/kg，在3 min內(nèi)推注完畢，而后以0.15μg/（kg·min）的速率維持滴注，維持量滴注持續(xù)36 h。

1.2.2 檢測(cè)方法 常規(guī)治療組次日清晨抽血，應(yīng)用替羅非班組12 h、24 h、36 h分別抽取患者血液標(biāo)本3mL，立即注入預(yù)先加有無(wú)菌3.8%枸櫞酸鈉0.2mL的抗凝管中備用。分離血單一核細(xì)胞：按文獻(xiàn)[5]進(jìn)行。按Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，將RNA在－70℃保存待測(cè)[6]。然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)，紫外凝膠圖像分析儀進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以目的基因mRNA擴(kuò)增后產(chǎn)物的光密度值與內(nèi)參照GAPDHmRNA擴(kuò)增后產(chǎn)物光密度值的比值作為mRNA表達(dá)的相對(duì)值。sCD40L、MMP－9及內(nèi)參GADPH的引物序列見(jiàn)表1。

表1 MMP－9和sCD40L的引物序列

2 結(jié) 果

替羅非班同時(shí)抑制MMP－9與sCD40L的表達(dá)，其作用亦呈時(shí)間依賴(lài)性。與常規(guī)治療相比，應(yīng)用替羅非班后12 h、24 h、36 h MMP－9的表達(dá)降低50%、73%和82%；sCD40L的表達(dá)降低32%、69%和88%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見(jiàn)表2。

表2 替羅非班對(duì)MMP－9、sCD40L表達(dá)的影響（±s）

表2 替羅非班對(duì)MMP－9、sCD40L表達(dá)的影響（±s）

與常規(guī)治療相比，1）P＜0.05

MMP－9m RNA sCD40LmRNA常規(guī)治療組 1.146±0.006 1.312±0.017組別替羅非班組12 h 0.878±0.0951） 1.118±0.0271）24 h 0.704±0.0131） 0.702±0.0221）36 h 0.502±0.0071） 0.492±0.0091）

3 討 論

動(dòng)脈粥樣硬化的本質(zhì)是慢性炎癥過(guò)程，單核/巨噬細(xì)胞是AS斑塊形成中最重要的細(xì)胞之一。CD40受體與CD40配體（CD40L）是一對(duì)互補(bǔ)跨膜蛋白，分別屬于腫瘤壞死因子受體（TNFR）和TNFR超家族成員，幾乎可在人AS病變中所有的細(xì)胞類(lèi)型（如巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞）中表達(dá)[2]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，不穩(wěn)定心絞痛組外周血可溶性CD40L水平、T細(xì)胞與血小板膜表面CD40L明顯高于穩(wěn)定心絞痛組與對(duì)照組，血清sCD40L濃度明顯升高者繼發(fā)生心肌梗死、中風(fēng)或心血管死亡率明顯增高，而對(duì)照組沒(méi)有心血管疾病發(fā)生[7]。體內(nèi)及體外的研究證實(shí)，不論是自身、局部或外源性的CD40L均可刺激粥樣斑塊相關(guān)細(xì)胞（淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞）表達(dá)和產(chǎn)生一系列與斑塊發(fā)生、斑塊破裂和血栓形成有關(guān)的活性物質(zhì)，如黏附分子、細(xì)胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶、組織因子等?；|(zhì)金屬蛋白酶是一種依賴(lài)Zn2＋和Ca2＋的酶家族，能特異性地與細(xì)胞外基質(zhì)各成分相結(jié)合，并降解胞外基質(zhì)。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)[4]，不穩(wěn)定斑塊，尤其是易發(fā)生破裂的斑塊“肩部區(qū)域”，MMP－9的蛋白及酶活性明顯增加，較穩(wěn)定斑塊高3倍～5倍，且這種 MMP－9的增加主要來(lái)源于斑塊內(nèi)的巨噬細(xì)胞。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，MMP－9能促進(jìn)急性冠脈綜合征的發(fā)生、發(fā)展，在臨床上可以作為斑塊的活動(dòng)性標(biāo)志。

大量臨床試驗(yàn)證明，抗血小板藥物在動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)疾病中能夠降低血管事件的發(fā)生率和病死率。傳統(tǒng)觀(guān)念認(rèn)為，這主要得益于抗血小板藥物抑制血小板聚集和血栓形成的作用。然而，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外為數(shù)不多的研究顯示，抗血小板藥物除能減少血栓形成外，還具有抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊進(jìn)展的作用[8，9]。替羅非班是抗血小板聚集的藥物，作用于血小板聚集的最后階段，即它阻斷了血小板表面Ⅱb/Ⅲa受體，抑制了纖維蛋白原形成。那么，它除了抑制血小板聚集，是否還通過(guò)其他的機(jī)制治療靶病變呢？國(guó)外已有體外實(shí)驗(yàn)證明，替羅非班能夠降低激活的血小板和內(nèi)皮細(xì)胞之間相互作用后產(chǎn)生MMP－2和MMP－9[10]。本研究發(fā)現(xiàn)替非羅班可明顯抑制sCD40L與MMP－9表達(dá)，其作用有時(shí)間依賴(lài)性，這與已有的報(bào)道結(jié)果相吻合。與常規(guī)治療組相比，應(yīng)用替羅非班后12 h、24 h、36 h后MMP－9的表達(dá)降低50%、73%和82%；sCD40L的表達(dá)降低32%、69%和88%，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。由此可以看出sCD40L與MMP－9表達(dá)變化的趨勢(shì)一致。因此，對(duì) MMP－9的抑制可能是通過(guò)拮抗CD40/CD40L通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的，從而具有抑制炎癥、穩(wěn)定粥樣斑塊作用，但其作用的靶點(diǎn)和具體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尚不明確。趙永平等[11]研究發(fā)現(xiàn)PPARγ有可能通過(guò)阻斷CD40/CD40L而對(duì)冠脈具有保護(hù)作用，是CD40－CD40L信號(hào)通路的上游調(diào)節(jié)機(jī)制，但尚需進(jìn)一步研究。

[1] Ross R.Atherosclerosis：An inflammatory disease[J].N Eng J Med，1999，340（2）：115－126.

[2] Mach F，Schonbeck U，Sukhova GK，et al.Functional CD40 is expressed on human vascular endothelial cells，smooth muscle cells and macrophages：Implications for CD40－CD40 ligand signaling in atherosclerosis[J].Proc Natl Acad Sci USA，2002，94（5）：1931－1936.

[3] 郭愛(ài)桃，韋立新，李向陽(yáng)，等.冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊組成成份與斑塊破裂的關(guān)系[J].中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，2010，7（6）：357－359.

[4] Harding SA，Sarma J，Josel DH，et al.Up－regulation，of the CD40/CD40 ligand dyad and platelet mioeyte agregation in cigrette smokers[J].Circulation，2009，109（16）：1926－1927.

[5] 沈關(guān)心，周汝麟.現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].武漢：湖北科學(xué)技術(shù)出版社，1998：1－5.

[6] 張利峰，楊志明，柴嬋娟.阿托伐他汀對(duì)THP－1源性巨噬細(xì)胞CD40及MMP－9的抑制作用[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志2009，7（1）：66－68.

[7] Schonbeck U，Mach F，Libby P.CD154（CD40 ligand）[J].J Biochem Cell Biol，2006，32：687－693.

[8] Cyrus T，Sung S，Zhao L，et al.Effect of low－dose aspirin on vascular inflammation，plaque stability，and antherogenesisin low－density lipoprotein receptor deficient mice[J].Circulation，2010，106（10）：1282－1287.

[9] 馮耀光，王雙，李方，等.THP－1巨噬細(xì)胞熱休克處理對(duì)單核細(xì)胞趨化蛋白－1和白細(xì)胞介素表達(dá)的影響[J].心肺血管病雜志，2010，3：12－13.

[10] Lin R，Liu J，Peng N，et al.Lovastatin reduces nuclear factor Kappa－B activation induced by C－reactive protein in human vascular endothelial cells[J].Biol Pharm Bull，2005，28：1630－1634.

[11] 趙永平，李毅夫，彭道泉，等.急性冠脈綜合征單核細(xì)胞過(guò)氧化物酶體增生激活型受體γ基因表達(dá)極其細(xì)胞粘附分子相關(guān)性研究[J].中華心血管病雜志，2009，29（10）：580－583.