中藥復方冠心康對大鼠缺血再灌注損傷心肌細胞Bcl－2、Bax 表達的影響1）

邱少波，梁 燕，劉 萍

隨著人口老齡化，冠心病的發病率和死亡率逐年增高，雖然通過溶栓、經皮冠狀動脈介入治療術等各種心肌保護技術，降低了死亡率，但心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）仍無法完全避免。而心肌細胞凋亡是多種心血管疾病發生發展中重要的細胞學基礎，大量研究表明，在眾多心臟疾病中如心力衰竭、心律失常、心肌病、心肌梗死等都有心肌細胞凋亡的發生[1]。大量的動物實驗研究發現，心肌細胞凋亡與MIRI有著密切關系，且凋亡在心肌細胞再灌注過程中起著關鍵作用[2]。中藥復方冠心康具有抗心肌缺血和緩解心絞痛的作用[3]，并能顯著縮短豚鼠模擬缺血早期和再灌注早期心肌90%動作電位時程[4]，在此研究基礎上，本實驗采用大鼠 MIRI模型，觀察中藥復方冠心康對大鼠MIRI心肌細胞凋亡因子Bcl－2、Bax表達的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD雄性大鼠，體重200 g～250 g，共40只，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，動物許可證號SYXK（滬）2010－0095。所有動物飼養于上海中醫藥大學附屬龍華醫院SPF級動物實驗中心。

1.2 實驗藥物 冠心康由黃芪、全瓜蔞、薤白、益母草、丹參、制半夏組成，均購于上海中醫藥大學附屬龍華醫院藥劑科，并煎成湯劑。鹽酸地爾硫卓片（恬爾心），浙江亞太藥業股份有限公司生產，產品批號20110303。

1.3 主要試劑 Bcl－2、Bax多克隆抗體為美國Santa Cruz公司產品，En Vision試劑（HRP/Rabbit）即用型丹麥Dako公司產品，Tunel試劑盒、蘇木素－伊紅均購自南京建成科技有限公司，3%戊巴比妥鈉、10%甲醛溶液等均為上海威奧生物科技有限公司提供。

1.4 主要儀器 小動物呼吸機：上海奧爾科特技術有限公司；多導電生理儀：Power Lab生物信號采集分析系統為澳大利亞埃德儀器國際貿易有限公司產品；切片機：德國Lico公司產品，型號：RM2145；微波爐：格蘭仕 WD800SL－4Ⅱ；隔水式恒溫培養箱：GNP－9270上海精宏實驗設備有限公司；電熱恒溫水浴鍋：DK－S22上海精宏實驗設備有限公司。

1.5 實驗分組 隨機分為4組：假手術組、MIRI模型組、冠心康組、鹽酸地爾硫卓組。

1.6 給藥時間和方法 術前灌胃7 d，每日灌胃1次。冠心康按生藥13 g/（kg·d）灌胃給藥。鹽酸地爾硫卓按30 g/（kg·d）灌胃給藥。假手術組和MIRI模型組分別于相同時間給予等容積的生理鹽水灌胃。

1.7 動物模型的建立及評價 于末次給藥1 h后，通過結扎大鼠左冠狀動脈前降支30 min，再灌注2 h，制備大鼠MIRI模型，以往已有實驗證實此缺血再灌注時間足以引起心肌細胞凋亡[5，6]。

將大鼠稱重量，3%戊巴比妥鈉，0.15mL/100 g，經腹腔注射麻醉后，仰臥固定。氣管插管，連接小動物呼吸機，呼吸頻率70次/min～80次/min，潮氣量8 mL～12 mL，呼吸氣比為1∶2，呼吸壓力1.5 k Pa～2.5 k Pa，同時用多導電生理儀Ⅱ導聯記錄心電圖。胸部脫毛，在心臟搏動最明顯處鈍性分離肌肉開胸，鈍性分離第3、4肋骨間肌肉，用眼科開瞼器打開視野，剪開胸膜、心包膜，充分暴露心臟。在左心耳下（相當于肺動脈圓錐與左心耳之間，距主動脈根部2.5 mm～3 mm處），用4－0帶線縫合針線穿過一小束心肌，將硅膠管置于結扎線與血管之間，拉緊結扎線，使硅膠管壓迫冠狀動脈左前降支而至閉塞，亦便于切斷結扎線再通。結扎后左室壁局部變蒼白，心電圖出現QRS波群變寬大畸形者為結扎成功。缺血30 min后，松解結扎線實現冠脈再灌注。再灌注后，可見左室壁蒼白部分逐漸紅潤，心電圖上寬大畸形的QRS波群變窄，波幅下降，提示再灌注成功。假手術組同樣手術但不結扎冠脈。

1.8 取材及檢測指標 造模成功后，將大鼠處死，剪取心臟，生理鹽水沖洗，在MIRI區域取材，作為組織標本。用10%甲醛液固定12 h，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋切片，檢測指標如下。

1.8.1 心肌組織病理學 切片厚度為4μm，常規蘇木素－伊紅（HE）染色。

1.8.2 心肌細胞凋亡的原位標記檢測 采用TUNEL法并嚴格按照試劑盒說明書操作。細胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞，即凋亡細胞。每張切片隨機選擇5個非重疊視野（400倍），計數陽性染色的心肌細胞數及心肌細胞總數，計算細胞凋亡指數（AI），AI＝陽性細胞數/心肌細胞總數×100%。

1.8.3 免疫組化檢測Bcl－2、Bax的表達 按照En Vision法進行免疫組化檢測，簡要步驟為：石蠟切片常規脫蠟至水，PBS沖洗3 min×3次，用p H6.0的0.01 mol/L檸檬酸緩沖液熱誘導修復（微波3檔，20 min），然后室溫自然冷卻，PBS沖洗3 min×3次，經0.3%H2O2室溫下20 min后，PBS沖洗3 min×3次，后經20%正常羊血清室溫孵育30 min，滴加一抗Bcl－2或Bax后37℃孵育2 h，PBS沖洗3 min×3次，之后用En Vision試劑37℃30 min，PBS沖洗3 min×3次，DAB顯色8 min～12 min，蘇木素染色，熱水藍化，在顯微鏡250倍下用圖形分析系統定量觀察。

2 結 果

2.1 心肌組織病理學改變 HE染色（光學顯微鏡×200倍）：假手術組心肌細胞排列整齊，細胞核居中，細胞膜完整，細胞著色均勻；MIRI模型組心肌細胞排列紊亂，部分區域有斷裂，細胞核固縮，細胞著色不均勻，區域性水腫變性明顯；冠心康組心肌細胞排列基本整齊，細胞著色相對均勻，水腫變性不明顯；鹽酸地爾硫卓組心肌細胞排列疏松，細胞著色不均勻，水腫變性稍明顯。

2.2 心肌細胞凋亡指數 光鏡下觀察，心肌細胞核呈藍色，而心肌凋亡陽性細胞的細胞核為深淺不一的棕褐色。結果顯示：與假手術組比較，MIRI模型組心肌細胞凋亡指數值顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；與 MIRI模型組比較，冠心康組和鹽酸地爾硫卓組明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。詳見表1。

表1 各組大鼠心肌細胞凋亡指數比較（±s） %

表1 各組大鼠心肌細胞凋亡指數比較（±s） %

與假手術組比較，1）P＜0.01；與 MIRI模型組比較，2）P＜0.01

組別 n 10 9.8±2.7 MIRI模型組 10 31.5±7.81）鹽酸地爾硫卓組 10 14.9±5.62）冠心康組 10 12.3±2.32）凋亡指數假手術組

2.3 心肌細胞凋亡因子Bcl－2、Bax的表達 抑制凋亡因子Bcl－2在MIRI后表達明顯降低，冠心康組和鹽酸地爾硫卓組表達則明顯升高，差異均有統計學意義（P＜0.01）。而促凋亡因子Bax在MIRI后表達明顯升高，冠心康組和鹽酸地爾硫卓組表達則明顯降低，差異均有統計學意義（P＜0.01）。詳見表2。

表2 各組心肌組織中Bcl－2、Bax的表達（±s） μm2

表2 各組心肌組織中Bcl－2、Bax的表達（±s） μm2

與假手術組比較，1）P＜0.01；與 MIRI模型組比較，2）P＜0.01

Bcl－2 Bax假手術組 10 292 007.7±32 530.3 86 718.9±9 927.5組別 n MIRI模型組 10 184 933.5±17 160.71）190 052.4±52 243.71）鹽酸地爾硫卓組 10 260 398.0±39 590.82）100 477.3±13 751.32）冠心康組 10 280 428.2±40 493.02） 92 511.0±15 950.92）

3 討 論

MIRI可誘導心肌細胞壞死，同時也可導致心肌細胞凋亡。1994年Gottlieb等[7]首先在兔心臟上發現再灌注損傷促進了細胞凋亡。隨著分子心臟病學研究的不斷深入，越來越多的證據表明細胞凋亡基因的調控在MIRI的病理生理過程中發揮著重要作用。

目前研究的凋亡調控基因主要為Bcl－2家族、Caspase家族、細胞色素C、凋亡誘導因子、p53等。其中Bcl－2基因家族是心肌細胞凋亡過程中極其重要的調節因子[8]。Bcl－2家族蛋白根據其功能主要分為兩大類：抑細胞凋亡因子，以Bcl－2、Bcl－x L為代表；促細胞凋亡因子，以Bax、Bad、Bak、Bid為代表。Bcl－2基因家族成員自身或與Bax彼此之間可形成二聚體或多聚體，通過蛋白－蛋白相互作用調節細胞的存活或凋亡。Bcl－2蛋白主要定位于線粒體外膜，起抑制凋亡的作用。而具有促凋亡作用的Bax蛋白則主要定位細胞質，當細胞受到凋亡因子的誘導，便向線粒體轉位。Bcl－2和Bax相互競爭，間接調節蛋白酶和核酸酶活性，從而雙相調節細胞凋亡。當Bax表達占優勢時促進細胞凋亡，而Bcl－2表達占優勢時則阻止細胞凋亡，因此有學者將 Bcl－2和 Bax稱為心肌細胞的“死亡開關”[9，10]。

冠心病在祖國醫學中屬于“胸痹”范疇，責之于本虛標實。MIRI是冠心病的一個病理環節，常見臨床表現主要為胸痛、胸悶、短氣、乏力等。中醫病機以氣虛痰濁血瘀多見。中藥復方冠心康以《金匱要略》中栝樓薤白半夏湯為基礎加減化裁而成。全方以黃芪為君，丹參、益母草為臣，補氣生血、活血祛瘀；佐以全瓜蔞、薤白、半夏，燥濕化痰、通陽解穢。前期研究發現其具有明顯的調脂、抗心肌缺血、緩解心絞痛的作用，深入研究發現本方可進一步開放離體大鼠MIRI心肌KATP通道，可明顯增加Ca2＋－Mg2＋－ATP酶、Na＋－K＋－ATP酶活性，抑制 Ca2＋超載、減輕Ca2＋內流；能夠明顯促進超氧化物歧化酶（SOD）的產生，有效清除氧自由基作用[11，12]。本實驗采用大鼠 MIRI模型，發現中藥復方冠心康組心肌細胞凋亡指數顯著降低，同時，抑凋亡因子Bcl－2的表達明顯升高，而促凋亡因子Bax的表達則明顯降低。

綜上所述，中藥復方冠心康可明顯減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷，其作用機制是通過調控心肌細胞的凋亡基因而發揮保護作用，但是，中藥復方的作用機制是多靶點的，是否還通過其他機制起到保護作用，仍需要進一步深入探討研究。

[1] Richard RN，Douglas LM.Apoptosis and the heart：A decade of progress[J].Mol Cell Cardiol，2005，38（1）：1－2.

[2] Lamendola P，Di Monaco A，Barone L，et al.Mechanisms of myocardial cell protection from ischemia/reperfusion injury and potential clinical implications[J].G Ital Cardiol（Rome），2009，10（1）：28－36.

[3] 劉萍，章怡祎，張靜生.中藥復方對損傷人血管內皮細胞表達細胞間黏附分子的影響[J].中國臨床康復，2006，10（27）：54－57.

[4] 韓向暉，張娜，劉萍，冠心康對豚鼠缺血再灌注心室乳頭肌電生理特性的影響[J].上海中醫藥雜志，2009，43（3）：58－62.

[5] McCully JD，Wakiyama H，Hsieh YJ，et al.Differential contribution of necrosis and apoptosis in myocardial ischemia－reperfusion injury[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2004，286（5）：H1923－H1935.

[6] Das S，Cordis GA，Maulik N，et al.Pharmacological preconditioning with resveratrol：A role of CREB－dependent Bcl－2 signaling via adenosine A3receptor activation[J].Am J Physioi Heart Cirl Physiol，2005，288（1）：H328－H335.

[7] Gottlieb RA，Burleson KO，Kloner RA，et al.Reperfusion injury induces apoptosis in rabbit cardiomyocytes[J].J Clin Invest，1994，94（4）：1621－1628.

[8] Kostyak JC，Hunter JC，Korzick DH.Acute PKCdelta inhibition limits ischemia－reperfusion injury in the aged rat heart：Role of GSK－3beta[J].Cardiovasc Res，2006，70（2）：325－334.

[9] Gross ER，Hsu AK，Gross GJ.The JAK/STAT pathway is essential for opioid－induced cardioprotection：JAK2 as a mediator of STAT3，Akt，and GSK－3 beta[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006，291（2）：H827－H834.

[10] Bao W，Behm DJ，Nerurkar SS.Effects of p38 MAPK inhibitor on angiotensinⅡ－dependent hypertension，organ damage，and superoxide anion production[J].J Cardiovasc Pharmacol，2007，49（6）：362－368.

[11] 陳富榮，張娜，劉萍.冠心康對大鼠缺血心肌細胞ATP敏感鉀通道亞基Kir6.1、Kir6.2、SUR2A、SUR2B表達的影響[J].中西醫結合學報，2010，8（5）：458－464.

[12] 張娜，陳富榮，章怡祎，等.冠心康對大鼠缺血心肌細胞ATP敏感鉀通的影響[J].中國中西醫結合雜志，2010，30（11）：1186－1189.