瑞舒伐他汀聯合氨氯地平對ox－LDL誘導的人單核巨噬細胞MMP－9mRNA 和蛋白表達的影響1）

張文英，高 振，屈巧芳，申曉彧

動脈粥樣硬化（atherosc lerosis，AS）是1個復雜的炎癥免疫反應病理過程[1]。其中，巨噬細胞吞噬氧化修飾的低密度脂蛋白（ox－LDL）在 AS的發生、發展中起著關鍵作用[2]。各種致動脈粥樣硬化的因素促進血管局部炎癥介質的生成，啟動血管壁的炎癥反應是AS發生發展的主要機制。其中ox－LDL是AS炎癥反應中重要的危險因素[3]。有研究發現，ox－LDL可增加單核細胞源巨噬細胞基質金屬蛋白酶－9（matrix metalloproteinase－9，MMP－9）表達并增強其活性，是細胞功能和基因表達的主要調節因子[4]。

瑞舒伐他汀（rosuvastatin）是新一代3－羥基－3－甲基戊二酰輔酶A（HMG－Co A）還原酶抑制劑，已有試驗證明瑞舒伐他汀可抑制ox－LDL誘導單核巨噬細胞 MMP－9mRNA和蛋白的表達[5]。氨氯地平（amlodipine）是廣泛用于臨床的第三代新型長效二氫吡啶類鈣通道阻滯劑（calcium channel blockers，CCB），臨床上主要應用于高血壓治療的一線用藥。雖然，有報道稱氨氯地平可以抑制單核細胞Lox－1、MMP－9的表達，從而起到穩定斑塊的作用，但瑞舒伐他汀聯合氨氯地平能否加強抑制高血壓合并冠心病患者單核巨噬細胞MMP－9mRNA和蛋白表達的作用，起到使斑塊更加穩定的作用有待進一步實驗證明。

本研究以健康人外周血單核巨噬細胞為對象，探討利用ox－LDL誘導后，不同濃度瑞舒伐他汀聯合氨氯地平對MMP－9mRNA和蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對象 健康成人靜脈血液來自山西醫科大學第二臨床醫院體檢中心；人淋巴細胞分離液（Lymphocytes Separation Medium1077）為上海華精生物高科技有限公司產品；RPMI－1640培養液；胎牛血清為杭州四季青公司產品；ox－LDL為北京協生生物科技有限公司產品；FITC－CD14抗體購自日本Beckman Coulter公司。RNA提取試劑盒（TransZol）購自北京全式金生物技術公司；逆轉錄－多聚酶聯反應（RT－PCR）試劑盒購自北京全式金生物技術公司；引物序列由上海生工生物有限公司合成；酶聯免疫（ELISA）試劑盒購自美國R＆D公司；瑞舒伐他汀為阿斯利康公司饋贈；氨氯地平為輝瑞制藥有限公司饋贈；其他試劑為國產或進口分析純。

1.2 人單核細胞來源的巨噬細胞的分離、培養、誘導和鑒定 密度梯度離心法分離健康人單核細胞。肝素抗凝靜脈血30mL分10個試管，RPMI－1640液1倍稀釋并充分混勻，分別緩慢加入等比例淋巴細胞分離液的離心管中，2 000 r/min離心20 min后，吸取中間環狀云霧狀淋巴細胞層，再以3mL PBS液充分混勻，1 500 r/min離心洗滌2次；10%胎牛血清的RPMI－1640各5mL將細胞吹開混勻，將細胞懸液每培養瓶4mL，并且每孔2mL再種于12孔板中，于37℃、5%CO2培養箱中孵育，培養至2代～4代后于細胞指數生長期用于誘導轉化實驗。誘導轉化時，以40 ng/mL的PAM無胎牛血清RPMI－1640培養液繼續培養48 h～72 h，待細胞轉化為巨噬細胞后以RPMI－1640培養液洗滌3次，置于10%胎牛血清的RPMI－1640培養液中繼續培養48 h。臺盼藍染色法測定細胞存活率。單核細胞源性巨噬細胞用特異性熒光素標記的CD14細胞表面抗體，流式細胞術進行細胞鑒定。

1.3 試驗分組 試驗共分8組。空白對照組：單獨單核巨噬細胞培養24 h；ox－LDL對照組：單核巨噬細胞經ox－LDL 100μg/mL誘導后單獨培養24 h；瑞舒伐他汀組：單核巨噬細胞用ox－LDL 100μg/mL誘導后培養2 h后，分3組，分別單獨加入瑞舒伐他汀（各0.01μmol/L、0.1μmol/L、1.0μmol/L）培養24 h；瑞舒伐他汀聯合氨氯地平組：單核巨噬細胞用ox－LDL 100μg/mL誘導后培養2 h后，分3組，第1組：加瑞舒伐他汀聯合氨氯地平各0.01μmol/L作用24 h；第2組：加瑞舒伐他汀聯合氨氯地平各0.1μmol/L作用24 h；第3組：加瑞舒伐他汀聯合氨氯地平各1.0μmol/L作用24 h。

1.4 半定量RT－PCR檢測 MMP－9m RNA的表達水平

1.4.1 RNA提取 棄培養瓶中的培養液，每瓶加入1.0 mL Trizol，依次加入氯仿、異丙醇沉淀，75%乙醇洗滌后略晾干，溶于25μL DEPC中。核酸紫外分析儀檢測，根據260/280比值，所有樣品的A260/A280的比值均介于1.9～2.0。并根據260 nm的吸光度值對樣品的總RNA進行初步定量，確定樣品中RNA純度和含量。

1.4.2 逆轉錄反應 逆轉錄反應在20μL體系中進行：含1μg RNA，20 mg/L 的 oligo（d T）引 物，1.0 mmol/L d NTP，20 U Rnase抑制劑，1×Buffer，200UM－MLV逆轉錄酶。于PCR儀上42℃反應1 h，72℃滅活10 min后保存于－20℃冰箱中。

1.4.3 PCR擴增反應 MMP－9上游引物序列為：5′－TCCCTGGAGACCTGAGAACC－3′；下游引物序列為：5′－GGCAAGTCTTCCGAGTAGTTT－3′。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min，94℃變性30 s，58℃退火60 s，72℃延伸60 s，循環29次；末次延伸7 min，產物長度為307bp。β－actin上游引物序列：5′－CCTGAGGCACTCTTCCAG－3′，下游引物序列：5′－TCACACTTCATGATGGA－3′，產物大小100bp。

1.4.4 凝膠電泳 取PCR產物10μL在瓊脂糖凝膠上電泳，計算機凝膠成像系統掃描拍照，Toptal軟件分析灰度值，以各條帶與B－actin內參條帶灰度的比值，代表MMP－9mRNA轉錄水平。

1.5 酶聯免疫吸附雙抗體夾心法（ELISA法）測定 MMP－9蛋白含量的表達 六孔培養板的上清液進行酶聯免疫吸附雙抗夾心法（enzyme linked immuno－sorbent assay，ELISA）測定，實驗操作嚴格按照試劑盒說明書進行，每組實驗重復7次。

2 結 果

2.1 單核巨噬細胞的形態學觀察和流式細胞術鑒定 單核巨噬細胞經培養、誘導后，25×16倍倒置顯微鏡光鏡下觀察，部分細胞為多角形，并且易于聚積、貼壁，說明已由單核細胞分化為巨噬細胞。經流式細胞術進行細胞鑒定，鑒定細胞多為單核巨噬細胞，符合實驗要求。

2.2 對ox－LDL誘導的單核巨噬細胞MMP－9m RNA及蛋白表達的影響 已經試驗證明經ox－LDL誘導單核巨噬細胞，可使MMP－9mRNA和蛋白的表達顯著增加，而加入瑞舒伐他汀共同培養24 h后，MMP－9mRNA和蛋白的表達明顯受到抑制，這種抑制作用隨加入瑞舒伐他汀劑量的增加而愈顯著，尤其當瑞舒伐他汀為10.0μmol/L幾乎完全抑制了 MMP－9mRNA和蛋白的表達[5]。本研究驗證，瑞舒伐他汀聯合氨氯地平后可使MMP－9mRNA和蛋白的表達較單獨加入瑞舒伐他汀時明顯下降。

2.2.1 對ox－LDL誘導的單核巨噬細胞 MMP－9m RNA表達的影響 與空白對照組比較，ox－LDL對照組、瑞舒伐他汀組MMP－9mRNA表達明顯增加（P＜0.05）；與空白對照組比較，ox－LDL誘導后不同劑量（0.01μmol/L、0.1μmol/L、1.0μmol/L）瑞舒伐他汀聯合氨氯地平組MMP－9mRNA表達也增加（P＜0.05）；與ox－LDL對照組、瑞舒伐他汀組比較，不同劑量（0.01 μmol/L、0.1μmol/L、1.0μmol/L）瑞舒伐他汀聯合氨氯地平組MMP－9mRNA表達明顯降低（P＜0.05）；經ox－LDL誘導后，不同劑量（0.01μmol/L、0.1μmol/L、1.0μmol/L）瑞舒伐他汀聯合氨氯地平各組之間比較，隨著瑞舒伐他汀聯合氨氯地平劑量增加MMP－9mRNA表達逐漸降低（P＜0.05）。詳見表1。

表1 各組MMP－9mRNA表達水平（±s）

表1 各組MMP－9mRNA表達水平（±s）

0.140 1±0.025 0 0.140 1±0.025 0 ox－LDL組 0.744 3±0.135 3 0.785 6±0.046 0 0.01μmol/L組 0.435 4±0.048 1 0.371 5±0.018 6 0.1μmol/L組 0.373 7±0.025 4 0.290 8±0.016 3 1.0μmol/L組組別 瑞舒伐他汀 瑞舒伐他汀聯合氨氯地平空白對照組0.262 8±0.036 4 0.226 8±0.015 5

2.2.2 對ox－LDL誘導的單核巨噬細胞MMP－9蛋白表達的影響 與空白對照組比較，ox－LDL對照組、瑞舒伐他汀組MMP－9蛋白表達明顯增加（P＜0.05）；與空白對照組比較，ox－LDL誘導后加入不同劑量瑞舒伐他汀聯合氨氯地平，各劑量（0.01μmol/L、0.1μmol/L、1.0μmol/L）組 MMP－9蛋白表達均是增加的，差異有統計學意義（P＜0.05）；與ox－LDL對照組、瑞舒伐他汀組比較，不同劑量（0.01μmol/L、0.1μmol/L、1.0μmol/L）瑞舒伐他汀聯合氨氯地平各組 MMP－9蛋白表達明顯降低（P＜0.05），這種降低隨著瑞舒伐他汀及氨氯地平劑量的增加而愈加顯著；經ox－LDL誘導后，不同劑量（0.01 μmol/L、0.1μmol/L、1.0μmol/L）瑞舒伐他汀聯合氨氯地平各組之間比較，隨著瑞舒伐他汀聯合氨氯地平劑量增加 MMP－9蛋白表達逐漸降低（P＜0.05）。說明瑞舒伐他汀聯合氨氯地平幾乎完全抑制了MMP－9蛋白的表達。詳見表2。

表2 各組MMP－9蛋白表達水平（±s）

表2 各組MMP－9蛋白表達水平（±s）

0.143 8±0.024 9 0.140 1±0.025 0 ox－LDL組 0.744 3±0.135 3 0.785 6±0.046 0 0.01μmol/L組 0.435 4±0.048 1 0.371 5±0.018 6 0.1μmol/L組 0.373 7±0.025 4 0.290 8±0.016 3 1.0μmol/L組組別 瑞舒伐他汀 瑞舒伐他汀聯合氨氯地平空白對照組0.262 8±0.036 4 0.226 8±0.015 5

3 討 論

ox－LDL在動脈粥樣硬化的形成和發展過程中起著關鍵的作用，ox－LDL參與內皮損傷、黏附分子的表達、白細胞的募集和潴留、泡沫細胞和血栓形成。另外，ox－LDL可刺激人單核巨噬細胞MMP－9的基因表達，增加基質金屬蛋白酶的活性，有可能促進粥樣硬化斑塊內基質的降解，形成易損的斑塊，并且，在ox－LDL存在下，MMP－9表達維持在較高水平，MMP－9過度的表達則抑制平滑肌增殖，促使其凋亡，減弱斑塊穩定性，參與了斑塊破裂的進程，促進粥樣硬化病變和血栓的形成，因此ox－LDL對人單核巨噬細胞MMP－9基因表達的影響，是動脈粥樣硬化病變的關鍵因素之一[6－8]。

細胞外基質降解是斑塊不穩定的主要原因。MMP是一類蛋白酶家族，主要由成纖維細胞、心肌細胞及斑塊中巨噬細胞、血管平滑肌細胞合成與分泌。MMP能特異性降解細胞外基質和斑塊纖維帽，其表達增加、活性增強可使斑塊穩定性降低，導致斑塊破裂[9]。有研究顯示有臨床急性缺血性腦卒中組患者頸動脈粥樣斑塊中的MMP－9逆轉錄水平和蛋白表達水平明顯高于無臨床卒中事件組和正常頸動脈組[10]，與文獻[11]研究結果類似。結果提示MMP－9可能是導致動脈粥樣硬化斑塊不穩定的主要因素。

他汀類藥物為 HMG－Co A還原酶抑制劑，其調脂作用肯定，并且可明顯降低致死性和非致死性心血管事件的發生，從而廣泛用于冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的一級和二級預防[12]。瑞舒伐他汀是一種被攝入后易進入動脈內膜的抗氧化質，在改善高膽固醇血癥患者的脂類水平方面，明顯優于阿托伐他汀、辛伐他汀和普伐他汀[13]，可極大程度降低心血管事件的發生率。有研究表明，瑞舒伐他汀可降低斑塊體積，抑制巨噬細胞內脂蛋白的積累，降低主動脈弓的低密度脂蛋白與低密度脂蛋白的斑塊比例[14]。

近年來，許多研究資料提出氨氯地平在不降低血脂及血壓的條件下，能延緩AS早期斑塊的形成，這一作用可能與其強親脂性和細胞膜上精確定位有關。氨氯地平是L型CCB，除具有此型的特性外，還具有與此型通道無關的多效性。這種作用不僅僅表現為對心血管的保護作用，還體現對頸動脈的保護作用，通過抗炎、抗氧化應激和保護內皮功能等多種機制實現。

氨氯地平降低血壓主要是依靠其對鈣通道的調節，然而其抗AS的許多機制并不依賴于其對鈣通道的調節作用。受損傷的內皮細胞高表達多種炎性因子，如細胞黏附分子、血管細胞間黏附分子和趨化因子等，而氨氯地平抑制這些因子的表達。單核細胞趨化蛋白1促使單核細胞和血管內皮細胞黏附、遷入內皮下，攝取脂質形成泡沫細胞是AS的早期病變。在抑制一氧化氮（nitric oxide，NO）致小鼠AS模型中，氨氯地平不僅抑制AS斑塊處單核細化蛋白1的表達 ，而且下調小鼠外周血單核細胞上單核趨化蛋白1受體的表達和Rho活性。PREVENT試驗結果表明，與安慰劑相比，冠心病患者長期服用氨氯地平可使心絞痛和心功能衰竭發作減少，血管重建率降低[15]。氨氯地平抑制白介素－1誘導基質金屬蛋白酶－1水平升高及其激發的內皮細胞溶膠原活性的增強，不僅影響酶的活性與表達，還能調節此酶組織抑制劑的轉錄，呈劑量依賴性抑制小鼠腹腔巨噬細胞MMP－2和9mRNA的表達，這可能對穩定AS斑塊，減少其破裂具有重要作用[16，17]。目前有研究表明，氨氯地平可以抑制單核細胞Lox－1、MMP－9的表達，從而起到穩定斑塊的作用。

本研究探討了單核巨噬細胞經ox－LDL誘導后，MMP－9 m RNA和蛋白的表達較未經ox－LDL誘導的單核巨噬細胞顯著增加，而使用瑞舒伐他汀聯合氨氯地平進行干預，干預后 MMP－9m RNA和蛋白的表達較單獨使用瑞舒伐他汀顯著下降，并隨著瑞舒伐他汀聯合氨氯地平計量的增加，下降的愈加顯著。且這種抑制作用隨著瑞舒伐他汀聯合氨氯地平劑量的增加而愈顯著，并呈劑量－效應關系。

本研究探討了瑞舒伐他汀聯合氨氯地平干預ox－LDL誘導的單核巨噬細胞 MMP－9mRNA及蛋白表達之間的關系，通過實驗證明瑞舒伐他汀聯合氨氯地平可降低經ox－LDL誘導的單核巨噬細胞MMP－9m RNA及蛋白表達，且較單獨使用瑞舒伐他汀抑制作用增強。考慮瑞舒伐他汀聯合氨氯地平可能通過ox－LDL途徑抑制單核巨噬細胞表達 MMP－9，從而起到穩定粥樣斑塊和抗炎的作用，從而改善冠心病患者預后。但未對其細胞內信號轉導的具體機制做進一步研究，需進一步研究探討。

[1] Libby P，Ridker PM，Maser IA.Inflammation and atherosclerosis[J].Circulation，2002，105（3）：1135－1143.

[2] Li AC，G lass CK.The macrophage foam cell as a target for therapeutic intervention[J].Nat Med，2002，8（11）：1235－1242.

[3] Farmer JA，Torre －Amione G.Atherosclerosis and inflammation[J].Curr Atheroscler Rep，2002，4（2）：92－98.

[4] Libby P，Theroux P.Pathophysiology of coronary artery disease[J].Circulation，2005，111：3487－3488.

[5] 高振，屈巧芳，申曉彧.瑞舒伐他汀對ox－LDL所誘導單核巨噬細胞 MMP－9表達的影響[J].中國心血管病研究，2010（12）：929－934.

[6] Newby AC.Dual role of matrix metalloproteinases（matrixins）in intimal thickening and atherosclerotic plaque rupture[J].Physiol Rev，2005，85（1）：1－31.

[7] 王長謙，湯大鳴，謝秀蘭，等.氧化型低密度脂蛋白對人血單核細胞基質金屬蛋白酶表達及活性的影響[J].中國動脈硬化雜志，2006，11（2）：126－128.

[8] Wu M，Li YG.The expression of CD40/CD40L and activities of matrix metalloproteinases in atherosclerotic rats[J].Mol Cell Biochem，2006，282（122）：141－146.

[9] Inokubo Y，Hanada H，Ishizaka H，et al.Plasma levels of matrixmetallo－proteinase－9 and tissue inhibitor of metalloproteinase－1 are increased in the coronary circulation in patients with acute coronary syndrome[J].Am Heart J，2001，141（2）：211－217.

[10] Albert Ma，Danielsone，Rifain，et al.Effect of statin therapy on Creactive protein levels：Pravastatin inflammation/CRP evaluation（PRINCE）：A randomized trial and cohort study[J].JAMA，2001，286（1）：64－70.

[11] Johnson JL.Matrix metalloproteinases：Influence on smooth muscle cells and atherosclerotic plaque stability[J].Expert Rev Cardiovasc Ther，2007，5：265－282.

[12] 趙清珍，劉坤申.他汀類藥物強化調脂在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病防治中的作用[J].新醫學，2007，38（11）：758－760.

[13] Quirk J.Thomton M.Kirkpatrick P.Rosuvastatin calcium[J].Nat Rev Drug Discov，2003，2（10）：768－769.

[14] Verreth W，De Keyzer D.Rosuvastatin restores superoxide dismutase expression and inhibits accumulation of oxidized LDL in the aortic arch of obese dyslipidemic mice[J].Br J Pharmacol，2007，151（3）：347－355.

[15] Fuman C，Luo Z，Walsh K，et al.Systemic tissue inhibitor of metalloproteinase－1 gene delivery reduces neointimal hyperplasia in balloon injured rat carotid artery[J].FEBS Lett，2002，531（2）：122.

[16] 徐麗梅，涂玉林.氨氯地平抗動脈粥樣硬化研究進展[J].中國動脈硬化雜志，2008，16（3）：241－243.